抗草甘膦杂草的抗性机理研究进展

巩元勇， 郭书巧， 束红梅， 王庆南， 倪万潮

(1.江苏省农业科学院经济作物研究所/农业部长江下游棉花和油菜重点实验室，江苏 南京 210014； 2.江苏丘陵地区南京农业科学研究所，江苏 南京 210046)

巩元勇，郭书巧，束红梅，等. 抗草甘膦杂草的抗性机理研究进展[J]. 杂草科学，2012，30(3)：9-13.

抗草甘膦杂草的抗性机理研究进展

巩元勇1， 郭书巧1， 束红梅1， 王庆南2， 倪万潮1

(1.江苏省农业科学院经济作物研究所/农业部长江下游棉花和油菜重点实验室，江苏 南京 210014； 2.江苏丘陵地区南京农业科学研究所，江苏 南京 210046)

草甘膦因其独特而优异的理化特性，自上市起便受到广泛的关注，现在已经成为全世界应用最广的除草剂之一。但是随着草甘膦抗性杂草的不断出现，草甘膦的应用前景受到严峻的挑战。文章综述了草甘膦生产及应用现状、草甘膦作用机理和草甘膦抗性杂草的发展，重点阐述了草甘膦抗性杂草的抗性机理。最后对如何通过延缓草甘膦抗性杂草的出现，保护草甘膦提出建议。

草甘膦；草甘膦抗性杂草；EPSP合成酶

人类通过种植植物获取食物、纤维、燃料和饲料之前，杂草就已经出现，杂草存在的历史远远长于人类的种植史。上千年间人类耕作中的杂草防控主要是采用机械、栽培和生物的方式，直到20世纪40年代有机合成除草剂的出现，人类逐渐认识并采用这种省时、省力和高效的化学除草方式，化学除草已经成为当今农业生产主要防控杂草的手段。自2，4-二氯苯氧乙酸(2，4-dichlorophenoxyacetic acid，简称2，4-D)这第一个除草剂被选择使用以来，分属于不同化学级别并具有不同作用方式的除草剂如雨后春笋般在全世界范围内被合成并成功商业化，草甘膦[glyphosate，学名N-(膦酸基甲基)甘氨酸[N-(phosphonomethyl) glycine)]便是众多化学除草剂的后起之秀之一。

1 草甘膦生产及应用现状

美国孟山都公司在1970年成功研发出草甘膦，因其理化性质稳定，具有内吸传导性、广谱性、高效、低毒、低残留、不破坏土壤环境、对大多数植物具有灭生性等其他除草剂所不具有的优点[1]，自1974年上市销售以来，到1995年美国已销售450万kg，目前由于草甘膦专利技术到期，导致其销售价格大幅下降和1996年以来抗草甘膦作物的大面积推广，使得草甘膦的使用量超过了1995年的10倍以上[2]。2008年全球对草甘膦消费量更是达到60万t以上，预计2015 年全球草甘膦的需求量将达到89万～93万t左右[3]。我国自1980年开始生产草甘膦以来，逐渐成为全球生产和销售草甘膦的中心，2009年底我国草甘膦的生产能力达到64万t左右[3]，最近已经连续5年成为世界生产和出口草甘膦第一的国家[4]。随着草甘膦应用范围和使用量的不断扩大，我国现在也是草甘膦最大应用国，2009年我国草甘膦市场需求约为5.5万t，预计2015 年我国草甘膦的需求量将达到12万～13万t左右[3]。

2 草甘膦作用机理

莽草酸(shikimate pathway)途径是植物和微生物体内连接碳水化合物代谢和芳香族复合物生物合成的重要途径，在植物体芳香族复合物包括芳香族氨基酸(色氨酸，tryptophan)、酪氨酸(tyrosine)、苯丙氨酸(phenylalanine))和一些酚类次级代谢产物(生长素，auxins)、木质素(lignin)、细胞松弛素(phytoalexins)等[5]，由此不难看出莽草酸途径在植物生长发育过程中具有举足轻重的地位。5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶(5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate Synthase，EPSPS，EC 2.5.1.19)是莽草酸途径中催化磷酸烯醇式丙酮酸(phosphoenol pyruvate，PEP)和3-磷酸莽草酸(3-phosphoshikimate，S3P)合成5-烯醇式丙酮酸-3-磷酸莽草酸(5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate，EPSP)的关健酶[5]，草甘膦的作用方式是通过竞争性抑制PEP与EPSPS结合，形成稳定的三元络合物，从而阻断PEP与S3P反应生成EPSP[6]，最终阻止芳香族氨基酸的生物合成。EPSPS活性的抑制能够导致莽草酸在植物体的迅速积累[7]，最终导致植物的死亡。导致植物死亡的原因可能有3种：(1)阻断植物体内芳香族氨基酸和酚类次生代谢产物的合成；(2)S3P的积累会消耗大量的能量；(3)某些代谢途径中间代谢产物如NADP或S3P的积累对植物产生毒害[8]。

3 草甘膦抗性杂草的发展

截止到1996年，尽管已经使用草甘膦20多年，但是一直没有关于草甘膦抗性杂草的报道[9]。因此，一些杂草研究者过早地得出草甘膦抗性杂草的进化是不可能发生的论断。该结论的得出基于以下观点：20多年草甘膦的使用时间，杂草没有发生对草甘膦抗性的进化；植物体缺少对草甘膦的代谢机制；缺乏理想的实验室改造的EPSPS位点突变的酶动力学；抗草甘膦作物的研发成功需要有细菌基因的插入，这在自然条件下的杂草中不会发生[10- 11]。然而随着1996年抗草甘膦作物商业化种植的推广，彻底改变了草甘膦以往的使用模式，开始单一的并在作物萌发前和萌发后等不同生长发育期重复多次使用，在这种高强度的选择压力下，在数个国家和地区尤其是抗草甘膦作物农田中发现了15种抗草甘膦杂草[12]。

1996年，澳大利亚的瑞士黑麦草(Loliumrigidum)是最早报道的具有草甘膦抗性的杂草[13]。1999年底，智利果园中发现草甘膦对多花黑麦草(Loliummultiflorum)的防治效果很差[14]。2000年，在马来西亚发现当地的牛筋草(Eleusineiudica)对草甘膦的抗性提高了8～12倍[15]。同年在美国东部特拉华州抗草甘膦转基因大豆的农田中发现有草甘膦抗性的小蓬草(Conyzacanadensis)[16]。2001年，美国加州及南非发现了同样具有草甘膦抗性的瑞士黑麦草[17-18]。2003年，抗草甘膦的长叶车前草(Plantagolanceolata)和野塘蒿(Conyzabonariensis)在南非被发现。2004年，美国发现抗草甘膦的豚草(Ambrosiaartemisiifolia)[19]和马齿苋(Portulacaoleraces)[20]。2005年，美国乔治亚州传统农田发现长芒苋(Amaranthuspalmeri)具有草甘膦抗性[19]。同年，美国的具瘤苋(Amaranthusrudis)和三裂叶豚草(Ambrosiatrifida)以及巴西和阿根廷分别发现的猩猩草(Euphrbiaheterophylla)和假高粱(Sorghumhalepense)都能抗草甘膦[19]。2007年，抗草甘膦的光头稗(Echinochloacolonum)在澳大利亚被发现[19]。我国抗草甘膦杂草也陆续被发现并报道，抗草甘膦的小蓬草在浙江宁波被发现[21]。此外，果园中的许多杂草如刺儿菜(Cephalanoplossegetum)、问荆(Equisetumarvense)、苣荬菜(Sonchusbrachyotus)等多年生杂草对草甘膦也不敏感[22]。华北麦田中的优势杂草打碗花(Calystegiahederacea)、田旋花(Convolvulusarvensis)对草甘膦也表现有抗性[23]。

4 草甘膦抗性机理

杂草对草甘膦抗性的产生至少有3种机制造成：(1)靶标酶EPSPS的改变；(2)除草剂在植物体的区室化或转运方式的改变；(3)除草剂代谢速率的改变。前两种机制已经在抗性杂草中得到了证实，第三种机制在抗性杂草中还没有被发现[24]。靶标酶EPSPS的改变通过EPSPS基因的突变或者EPSPS的过量表达来实现，牛筋草、瑞士黑麦草、意大利黑麦草、马齿苋和高水麻(Amaranthustuberculatus)就是通过这种机制实现的对草甘膦的抗性[24]。降低草甘膦向分生组织的转运，通过在喷施部位对草甘膦的区室化实现，这一机制已经在瑞士黑麦草、香丝草(Conyzabonariensis)和小蓬草中得到了证实[24]。

4.1 靶标酶EPSPS基因的突变

2000年，Lee和Ngim首次报道在马来西亚发现具有草甘膦抗性的牛筋草[25]，由于草甘膦价格的降低导致了对其年使用频率增加(6～8次/年)，在如此高强度的草甘膦选择压力下最终导致了抗性牛筋草的发生[26]。研究发现，必须使用对敏感型杂草3倍以上的草甘膦浓度才能够达到抑制抗性牛筋草EPSPS活性的50%，表明草甘膦对抗性牛筋草EPSPS的敏感性显著降低[27]。Baerson等指出，抗草甘膦牛筋草EPSPS编码基因第319个核苷酸由胞嘧啶C变为胸腺嘧啶T，由此导致EPSPS氨基酸序列第106位氨基酸由脯氨酸变为丝氨酸，从而诱发了抗草甘膦牛筋草的出现[27]。Ng等的研究表明，在抗性牛筋草中同时存在EPSPS编码基因第319个核苷酸由胞嘧啶C变为腺嘌呤A，导致EPSPS氨基酸序列第106位氨基酸由脯氨酸变为苏氨酸的情况存在，同样具有相同的草甘膦抗性[28]。丝氨酸和苏氨酸是极性亲水氨基酸，而脯氨酸是非极性疏水氨基酸，这种氨基酸的改变必然导致EPSPS结构和功能的改变，造成EPSPS与草甘膦亲和力的降低，由此导致牛筋草对草甘膦产生抗性[29]。同样，澳大利亚和智利的黑麦草(Loliumperenne)对草甘膦的抗性也是采用相同的机制[30-31]。

4.2 靶标酶EPSPS的过量表达

在包括瑞士黑麦草在内的草甘膦抗性杂草中发现其EPSPS基因在mRNA水平的表达量增加了2～3倍[32]，但是这种增加不能够提供很强的草甘膦抗性。2004年在美国南部的棉田里首次发现有草甘膦抗性的马齿苋存在[20]，抗性杂草的出现归咎于常年种植抗草甘膦棉花而重复大量使用草甘膦所致。Gaines等2010年研究发现，抗草甘膦马齿苋体内EPSPS基因存在过量表达现象，过量存在的EPSPS为PEP和S3P提供了额外的活性结合位点，从而保证了莽草酸途径的正常代谢[33]。抗草甘膦马齿苋个体的EPSPS基因拷贝数平均为敏感型杂草体内EPSPS拷贝数的77倍，其EPSPS基因mRNA表达量平均数超过敏感型杂草体内EPSPS mRNA表达量的35倍，其EPSPS酶的数量平均值超过敏感型杂草体内的20倍。研究还发现，抗草甘膦马齿苋和敏感型马齿苋体内的EPSPS酶对草甘膦具有相同的敏感性，由此排除了EPSPS基因突变导致草甘膦抗性的可能[33]。Gressel等2011年研究表明，在抗草甘膦高水麻的基因组中EPSPS基因存在多拷贝现象，但现在还不明确这是否是该杂草草甘膦抗性存在的唯一机制[34]。

4.3 草甘膦在植物体内转运方式的改变

草甘膦通过阻断植物体莽草酸代谢途径导致植物死亡，而莽草酸代谢途径活跃的部位在植物的生长点，因此草甘膦向植物生长点的顺利转运显得非常重要[35]。草甘膦在植物体的韧皮部跟随蔗糖流由源叶组织向库组织运输[36]。1998年澳大利亚最早报道存在抗草甘膦的黑麦草[13]，多项研究表明其草甘膦抗性的出现不是由于EPSPS对草甘膦的亲和力降低和草甘膦的代谢造成的，而是草甘膦在处理叶片向植物其他组织的运输降低所致[37]。2000年在美国德拉华州的转基因大豆田中发现抗草甘膦小蓬草[16]，随后在美国的其他地方也证实存在抗草甘膦小蓬草[38]，研究发现这些抗性杂草最主要的抗性机理是草甘膦运输速率的降低[39]。相同的抗性机理在抗草甘膦生物型香丝草和意大利黑麦草中也得到证实[40- 41]。Ge等2010年采用31P NMR技术研究草甘膦在抗性和敏感型小蓬草细胞内的分布情况，结果显示抗草甘膦小蓬草会迅速的将草甘膦隔离进入液泡，由此降低了草甘膦通过韧皮部在植物体的运输速率[42]。此外，在对抗草甘膦黑麦草和假高粱的抗性机理研究中发现，减少叶片对草甘膦的吸收也可以产生草甘膦抗性[24]。抗草甘膦三裂叶豚草喷施草甘膦之后，其被喷施叶片会迅速干枯并脱离植物体，来减少草甘膦对植物体生长点的损害[43]。但是这两种作用机制还需要深入研究。

5 结论

草甘膦抗性杂草种类的频繁出现以及对其抗性机制的多样性，使我们深刻的认识到，任何一种除草剂都不是无懈可击的，都会伴随对该除草剂抗性的进化发生。一些除草剂会在杂草管理中被单一使用，例如在草甘膦抗性作物农田中，草甘膦被单一使用防除杂草，这必然会显著增加对田间杂草的选择压力，从而使得一种或多种杂草被选出具有抗性就在所难免。草甘膦抗性的出现，不仅对草甘膦的使用构成威胁，而且会由于因此而采用如粗放型耕作等其他除草管理方式而给生态环境带来负面影响[43]。为防止草甘膦抗性杂草的继续出现，同时为了更好的延续优秀除草剂的使用寿命，我们从杂草管理方式和除草剂抗性作物的研制两个方面提出建议：杂草管理必须引入多样性理念，注重不同作用机理除草剂使用的多样性以及田间耕作方式和作物品种的多样性[23]；研发具有多种除草剂复合抗性转基因作物，避免因单一抗性而使用单一除草剂以增加选择压的风险。

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AdvancesonResistanceMechanismofGlyphosate-ResistantWeeds

GONG Yuan-yong1, GUO Shu-qiao1, SHU Hong-mei1, WANG Qing-nan2， NI Wan-chao1

(1. Institute of Industrial Crops，Jiangsu Academy of Agricultural Sciences/Key Laboratory of Cotton and Rape in Lower Reaches of the Yangtze River, Ministry of Agriculture of China, Nanjing 210014, China； 2. Nanjing Institute of Agricultural Sciences, Nanjing 210046, China)

Glyphosate, because of its unique and excellent physical and chemical properties, has attracted much attention since it was commercialized. At present, glyphosate has become one of the most widely used herbicide around the world. But with the emergence of glyphosate-resistant weeds population, the application prospect of glyphosate has been seriously challenged. In this paper it was reviewed in the production and application status, the mechanism of action of glyphosate and the development of glyphosate-resistant weeds especially focused on introduction of the resistance mechanism of glyphosate-resistant weeds. Finally, how to delay the emergence of glyphosate-resistant weeds to protect the application of glyphosate has been also proposed in this paper.

glyphosate; glyphosate-resistant weeds; EPSPS

S451

A

1003-935X(2012)03-0009-05

2012-07-26

国家自然科学基金(编号：31101452)；江苏省博士后科研资助计划(编号：1201031B)；江苏省自然科学基金(编号：BK2010465)；江苏省农业科学院博士后科研资助计划(编号：012066511108)。

巩元勇(1982—)，男，山东惠民人，博士，助理研究员，主要研究方向为草甘膦抗性基因的发掘。E-mail：gongyuanyong1982@163.com。

倪万潮，研究员。E-mail：niwanchao2002@yahoo.com.cn。