抑癌基因WWOX和FHIT在膀胱尿路上皮癌中的表达及其临床意义

陕 光 夏 樾＊ 唐 甜

（1武汉大学人民医院泌尿Ⅱ科；2武汉大学人民医院肿瘤Ⅱ科 武汉430060）

近年来发现的抑癌基因WW结构域（WWOX）和脆性组氨酸三联体（FHIT）中各包含着一个最活跃、最不稳定、易发生断裂、重排和基因重组的常见脆 性 位 点 FRA16D 和 FRA3B［1－2］。 有 研 究 发 现WWOX／FRA16D和FHIT／FRA3B与多种肿瘤的发生、发展及转移密切相关，且二者减少在多种肿瘤中具有协同性［3］。

本文采用免疫组化和图像分析方法检测和分析了膀胱尿路上皮癌组织中WWOX和FHIT的表达以及二者的表达与膀胱尿路上皮癌临床病理因素的关系，以期能进一步阐明膀胱癌发生、发展的分子生物学机理，寻找早期预测膀胱癌发生发展的分子生物学标记物，有望能为膀胱尿路上皮癌的诊治提供新的靶点。

材料和方法

1.材 料

收集武汉大学人民医院病理科2006-2009年膀胱尿路上皮癌存档蜡块50例（均经病理学证实为膀胱尿路上皮癌），其中男性38例，女性12例，平均年龄50.3岁，另5例癌旁组织距瘤缘3-5cm。

1.1 标本均经 HE染色，光镜观察诊断，按WHO尿路肿瘤组织学分类（2004），浸润性尿路上皮癌30例。非浸润性乳头状尿路上皮癌，高级别15例，低级别5例。按UICC临床分期，T1 31例，T2 11例，T3-4 8例。其中未经化疗的初发肿瘤28例，化疗后复发肿瘤22例。

1.2 主要试剂

即用型兔抗人WWOX多克隆抗体；即用型兔抗人FHIT多克隆抗体；超敏即用型SP通用型免疫组织化学试剂盒；DAB显色试盒及多聚赖氨酸（北京中杉生物技术有限公司）

2.方 法

2.1 HE染色

常规取材、固定、脱水、透明、包埋、切片、HE染色及封片。

2.2 免疫组织化学SP法检测 WWOX和FHIT相关抗原

具体操作步骤：按说明书新鲜配置的DAB显色液显色，光镜下控制反应时间（约3-5min），苏木素复染，中性树胶封片并镜检；用PBS代替一抗作为阴性对照组，购买的阳性片作为 WWOX和FHIT的阳性对照组。

2.3 免疫组织化学结果判断

（1）WWOX和FHIT以细胞核或胞浆出现棕黄色颗粒为阳性反应，阴性对照组除细胞核染成蓝色外，应无棕黄色反应物。

（2）采用HPIAS-1000高清晰度彩色病理图文报告管理系统（同济千屏影像公司）对 WWOX和FHIT的表达进行定量分析，每张切片随机选取5个完整而不重叠的高倍镜视野（×400），测定每个视野下阳性反应的平均光密度、阳性反应面积和所有细胞总面积，计算阳性面积率。以每例5个视野的平均光密度、阳性面积率的平均值作为该例的测量值。（阳性面积率＝单位面积中阳性反应的总面积／单位面积中细胞的总面积×100%）

3.统 计学处理

对各组免疫组织化学反应阳性颗粒的平均光密度、阳性面积率作单因素方差分析和q检验，检验水准α为0.05。

结 果

1.H E染色

非浸润型尿路上皮癌：癌组织呈乳头状，移行上皮较厚，细胞层次较多，细胞核大小不一致，有些核较大染色较深，可见核分裂相，有些癌细胞可浸润至固有层（图1）。

浸润性尿路上皮癌：癌细胞高度未分化，细胞大小、形态不一，排列紊乱。很少或无乳头状结构有的形成不规则的巢状，有的分散。常有多数瘤巨细胞。多数核不规则，染色深，核分裂相较多。癌组织多浸润到膀胱壁肌层（图2）。

2.W WOX的表达

非浸润型膀胱尿路上皮癌细胞内可见少量棕黄色颗粒，WWOX表达弱，呈阴性（图3）；浸润性尿路上皮癌细胞内可见少量棕黄色颗粒，WWOX表达弱，呈阴性（图4）；癌旁组织胞核内可见较多的棕黄色颗粒，WWOX表达强，呈阳性（图5）。图像分析结果见表1。经q检验，膀胱尿路上皮癌与癌旁组织之间，WWOX的平均光密度及阳性面积率有显著性差异（P＜0.05，表1）。

3.F HIT的表达

非浸润型膀胱尿路上皮癌细胞中可见少量的棕黄色颗粒，FHIT表达弱（图6）；浸润性尿路上皮癌细胞内可见少量棕黄色颗粒，FHIT表达弱，呈阴性（图7）癌旁组织中可见密集分布的棕黄色颗粒，FHIT呈阳性表达（图8）。图像分析结果见表2。经q检验，膀胱尿路上皮癌与癌旁组织之间，FHIT的平均光密度及阳性面积率有显著性差异（P＜0.05，表2）。

表1 膀胱尿路上皮癌和癌旁组织WWOX表达的平均光密度和阳性面积率 （¯x±s）Table 1 The average optical density and the rate of positive area of WWOX in Bladder Urothelial Cancer and cancer side tissue （¯x±s）

表2 膀胱尿路上皮癌和癌旁组织FHIT表达的平均光密度和阳性面积率 （¯x±s）Table 2 The average optical density and the rate of positive area of FHIT in Bladder Urothelial Cancer and cancer side tissue （¯x±s）

讨 论

膀胱尿路上皮癌是我国发病率最高的泌尿系统肿瘤，在世界范围内，每年大约有357 000例新发病例，同时，有大约145 000例患者死于膀胱癌［4－5］，目前发病率呈上升趋势。这其中，大部分是膀胱尿路上皮癌。新发膀胱尿路上皮癌中75%的病例是表浅的肿瘤［6］。有资料显示术后2年内有大约60-85%的病例复发，并且有约15-23%的复发肿瘤进展成为肌层浸润的高分期肿瘤［7－8］。因此，研究与膀胱癌发生发展的分子生物学机理，寻找早期预测膀胱癌发生发展的分子生物学标记物，为膀胱癌的发生和复发的预测提供一定的参考依据具有重要的临床意义。

CFS家族包含常见基因如FHTI、WWOX、Parkin、GRDI2、DMD、CNTNAP2、LRPIB、CTNNA3等，其中脆性位点基因FHTI、WWOX、Parkin是三个最活跃的基因。FHTI基因是最早发现的脆性位点抑癌基因，它位于脆性位点FRA3B内，多种肿瘤细胞和肿瘤组织中发现其等位基因的缺失［9－12］。然后，许多肿瘤中发现Fhit蛋白表达缺失或减少。FHIT基因和WWOX基因作为较早确定且与脆性位点相联系的抑癌基因，在抑癌基因家族中地位举足轻重。大量文献证实FHTI基因和WWOX基因与肿瘤的发生发展相关，与肿瘤的预后密切相关［13－15］。

在多种肿瘤中，存在着FHIT表达缺失或降低，如肺癌、食管癌、消化道癌等，FHIT过表达能促进细胞凋亡［16－18］。研究还发现FHIT与引起癌症发生的关键蛋白质如cyclinD1和src之间有着交互作用［19］。FHIT基因变异是癌或癌前病变的早期事件，在癌症发生早期即存在着FHIT表达缺失或降低说明其有发生转移的更大可能性。

我们采用免疫组织化学的方法，对膀胱尿路上皮癌组织中FHIT基因和WWOX基因的表达进行检测，旨在探讨它们与膀胱尿路上皮癌发生发展的关系。结果表明：FHIT基因和WWOX基因在膀胱尿路上皮癌中呈低表达，癌旁组织中呈高表达。提示：WWOX基因在膀胱尿路上皮癌中表达明显缺失，是膀胱尿路上皮癌组织中的频发事件，但在正常膀胱上皮组织中高表达。WWOX在膀胱移行细胞癌的早期发生及发展中有重要作用，并可能成为诊断膀胱尿路上皮癌的早期诊断指标。膀胱尿路上皮癌中FHTI基因失活的机制认为：基因组的稳定性由高度保守的错误修复序列如hMSH2等维护，当这些序列发生突变时，将导致抑癌基因失活，肿瘤发生。

有研究表明，FHTI基因在细胞凋亡和细胞周期中发挥重要作用，在FHTI基因缺失的肿瘤细胞中导入FHTIDcNA使FHTI蛋白重新表达，可引起阻滞于S期和GO／G1期的细胞数增多，凋亡细胞数增多，致癌性下降。不同细胞系中转染FHTI基因的研究表明FHTI基因可能启动了不同于P53和Rb基因的凋亡途径发挥了抑癌［20］作用。最近的研究表明，FHTI蛋白主要定位于细胞核及质膜，推测它可能作为信号分子发挥作用，但具体的作用通路尚不清楚。有关FHTI蛋白的功能及作用机制有待进一步研究。

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图 版 说 明

图1 非浸润型尿路上皮癌：癌组织呈乳头状，移行上皮较厚，细胞层次较多，可见核分裂相。（HE×200）

图2 浸润性尿路上皮癌：癌细胞大小、形态不一，排列紊乱。很少或无乳头状结构，有的形成不规则的巢状。多数核不规则，染色深，核分裂相较多。（HE×200）

图3 WWOX的表达：非浸润型尿路上皮癌 细胞核和胞浆内可见极少量的棕黄色颗粒，WWOX呈阴性表达。（S-P×200）

图4 WWOX的表达：浸润性尿路上皮癌 细胞内可见少量棕黄色颗粒，WWOX表达弱，呈阴性。（S-P×200）

图5 WWOX的表达：癌旁组织 细胞核和胞浆内可见较多棕黄色颗粒，WWOX呈阳性表达 。（S-P×2000）

图6 FHIT的表达：非浸润型尿路上皮癌 细胞核和胞浆内可见极少量的棕黄色颗粒，FHIT呈阴性表达。（S-P×200）

图7 FHIT的表达：浸润性尿路上皮癌 细胞内可见少量棕黄色颗粒，FHIT表达弱，呈阴性。（S-P×200）

图8 FHIT的表达：癌旁组织 细胞核和胞浆内可见较多棕黄色颗粒，FHIT呈阳性表达。（S-P×200）

EXPLANATION OF FIGURES

Fig.1Noninvasive type urothelial carcinoma：carcinoma tissues is a papillary，transitional epithelium is thicker and the cellular level is more，nuclear division is visible in Noninvasive type urothelial carcinoma.（HE ×200）

Fig.2Invasive urothelial carcinoma：cancer cell size、shape is differ and arranging is disorderly.papillary structure is Little or no，some form irregular nests.Most nuclear is irregular with darker，nuclear division is more than.（HE x 200）

Fig.3The expression of WWOX Noninvasive type urothelial

carcinoma：There were few brown particles in the nucleus or cytoplasm，which showed WWOX expressed negative.（S-P×200）

Fig.4The expression of WWOX invasive type urothelial carcinoma：There were few brown particles in the nucleus or cytoplasm，which showed WWOX expressed negative.（S-P×200）

Fig.5The expression of WWOX：cancer side tissue.There were plenty of brown particles in the nucleus or cytoplasm，which showed WWOX expressed positive.（SP×200）

Fig.6The expression of FHIT Noninvasive type urothelial carcinoma：There were few brown particles in the nucleus or cytoplasm，which showed FHIT expressed negative.（S-P×200）

Fig.7The expression of FHIT invasive type urothelial carcinoma：There were few brown particles in the nucleus or cytoplasm，which showed FHIT expressed negative.（S-P×200）

Fig.8The expression of FHIT：cancer side tissue.There were plenty of brown particles in the nucleus or cytoplasm，which showed FHIT expressed positive.（S-P×200）