豆粕中大豆总异黄酮的提取工艺优化

李琴，邓秀霞，王留留，赵秀梅，李琦

（河南省郑州市质量技术监督检验测试中心，河南 郑州 450006）

豆粕中大豆总异黄酮的提取工艺优化

李琴，邓秀霞，王留留，赵秀梅，李琦

（河南省郑州市质量技术监督检验测试中心，河南 郑州 450006）

主要研究豆粕中大豆总异黄酮的醇提工艺,并用HPLC法测定大豆总异黄酮含量。以大豆总异黄酮为提取目的,并通过对各单因素的考察和正交试验对工艺进行优化。结果表明,大豆异黄酮醇提工艺的最佳条件为:乙醇浓度70%，料液比1∶15（mg/mL），提取温度80 ℃，提取4 h,分2次提取,第1次提取时间为3 h，第2次提取1 h，总提取量是16.11 mg/g。

大豆异黄酮；豆粕；提取工艺；优化；HPLC

大豆异黄酮（soybean is of lavones，SIF）是多酚类混合物，属于黄酮类化合物中的异黄酮成分，分为游离型的苷元（Aglycon）和结合型的糖苷（Glycosides）两类，苷元占总异黄酮含量的2%～3%，糖苷占总量的97%～98%[1-2]。

随着分析技术的发展，研究证明，大豆异黄酮经过动物体代谢后，主要以染料木素、黄豆苷元、大豆黄素以及它们的葡萄糖结合物的形式存在的染料木苷、黄豆苷、大豆黄苷。因此大豆异黄酮的生物活性主要体现在这6种单体成分上。大部分大豆异黄酮类化合物是以糖苷的形式存在的[3]。

研究表明，大豆异黄酮具有预防癌症、心血管疾病、骨质疏松症和降低妇女更年期综合症等生理功能[4-7]。在国外以大豆异黄酮为主要成分的保健食品已成为新型的畅销产品，但在国内，虽然大豆资源很丰富但只有很少几家生产该产品，仍处于开发利用的研究阶段，因此该产品具有广阔的开发前景和新的应用价值。通过对豆粕中这几种有效成分提取集中研究，减少分离过程的损失，从而充分利用资源。

1 材料与方法

1.1 主要原料及试剂

豆粕：郑州博凯生物有限公司提供；99.5%乙醇：宏大化工有限公司；色谱甲醇：天津四友精细化学品有限公司；大豆异黄酮对照品：华北制药有限公司；其它为分析纯。

1.2 主要仪器

HH－3恒温水浴锅：上海医疗器械厂；D－971搅拌器：巩义市予华仪器有限责任公司；LD4－2离心机：北京医用离心机厂；FL2200高效液相色谱仪：福立分析仪器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 工艺流程

豆粕（经粉碎，过40目筛）10g→石油醚（30℃～60℃）索氏抽提脱脂→干燥→乙醇回流提取→等电点沉淀冷冻除蛋白质→粗提液减蒸→水解→萃取精制→HPLC检测

1.3.2 大豆总异黄酮的提取

准确称取豆粕10 g，加石油醚索氏回流提取脂肪后，干燥，加入不同体积的不同提取溶媒在不同的温度下提取数次，合并滤液，冷冻等电点除蛋白，离心，取上清液过滤进行HPLC分析测定。

1.3.3 单因素试验

以乙醇浓度、料液比、提取温度、提取时间，分别取出少量浸提液，采用HPLC法在254 nm处进行大豆总异黄酮含量的测定考察对大豆异黄酮提取量的影响。

1.3.4 正交试验

由于在工艺优化过程中各因素的影响是相互联系的，因此为了全面考察影响因素，设计了一个四因素四水平的正交试验，考察乙醇浓度、物料比、温度、提取时间对大豆异黄酮提取量的综合影响，从中选择最佳的工艺条件。

2 结果和讨论

2.1 大豆总异黄酮的测定

2.1.1 色谱条件

选用色谱柱C18（4.6 mm×150 mm×5 μL)；柱温：室温；梯度洗脱（见表1），流速为1 mL/min，柱温室温，进样量为2 μL，检测波长254 nm。进样考察色谱图，以保留时间定性、峰面积定量、外标法计算。

表 1 HPLC梯度洗脱顺序表Table 1 HPLC gradient elution

2.1.2 大豆总异黄酮标准曲线的建立

精确称取对照品10 mg，用色谱甲醇定容至10 mL，经过0.22μm型（聚丙烯）WHATMAN一次性针头过滤器过滤。分别吸取0、0.2、0.4、0.6、0.8 mL定容至10 mL配成不同浓度的标样溶液,经HPLC测定不同浓度对应的峰面积。以浓度对相应的峰面积线性回归可得对照品的标准曲线。用Excel软件处理得回归方程为y=2624.7x+11.08。大豆总异黄酮峰面积与其相应浓度分别呈良好的线性相关，相关系数r＝0.9998。

2.1.3 样品的HPLC方法的测定

精确称取样品10 mg，用色谱甲醇定容至10 mL，经过0.22μm型（聚丙烯）WHATMAN一次性针头过滤器过滤，按照2.1.1的色谱条件进行HPLC测定分析，结果如图2所示，与图1相比较可以看出，豆粕提取物中异黄酮的保留时间和标准混合液中的大豆异黄酮保留时间一致。

2.1.4 精密度实验

准确吸取1.0 mg/mL大豆异黄酮对照品溶液进样（5 μL）重复试验5次，以总异黄酮的峰面积计算RSD，结果见表2。通过对标准对照品的5次平行测定，变异系数为1.21%，可见此方法的精密度良好。

2.1.5 回收率实验

取样品，分别加入一定量对照品混合溶液，重复进样6次，液相色谱法测定，计算样品的加样回收率和相对标准偏差，结果见表3。

表 2 精密度实验Table 2 Precission test

表 3 回收率实验Table 3 Recovery test

通过对同一样品的6次平行测定，回收率在98.5%到101.3%之间，变异系数为1.11%。

2.2 提取条件单因素的考察

2.2.1 不同的乙醇浓度对大豆异黄酮提取量的影响

为了得到最佳的大豆异黄酮提取量，对提取溶剂乙醇进行不同浓度的优化试验，选取乙醇水溶液浓度分别是：60%、65%、70%、75%、80%、95%进行大豆异黄酮的提取量试验，结果如图3所示。

70%的乙醇水溶液对大豆异黄酮的提取量较其它浓度的要多，且70%的乙醇使大豆蛋白质和多糖变性，从而减少了大豆蛋白质及多糖对大豆异黄酮提取的干扰，简化了后续的处理工作，更适于工业化生产。

2.2.2 料液比对大豆异黄酮提取量的影响

豆粕与乙醇溶剂的比例不同，提取得到的大豆异黄酮总量也有很大的差异，为了使豆粕中大豆异黄酮能够充分提取，进行了料液比的条件优化试验，见图4。

从图4中可以看出，随着料液比的增加，大豆异黄酮的提取量也随着增加，但到达一定的程度后，呈下降趋势，因此选择料液比为1∶15时，大豆异黄酮提取量最大，提取效果最好。

2.2.3 提取温度对大豆异黄酮提取量的影响

提取温度不同，大豆异黄酮的提取量也将随之发生变化，为了得到最佳的大豆异黄酮提取量，对提取温度进行了优化试验，结果如图5所示。

从图5中可以看出，当提取温度80℃，大豆总黄酮的提取效果较好，这是因为温度较低时，大豆总黄酮溶出较少，而温度过高，可能大豆异黄酮分解而使含量降低。

2.2.4 提取时间对大豆异黄酮提取量的影响

提取时间对大豆异黄酮的提取量也有很大的影响，时间太短，不能充分提取，提取量自然降低，提取时间太长，不但大豆异黄酮的提取量没有明显的增加，反而增加了能耗和物耗，因此，对提取时间进行了优化试验，结果如图6所示。

由图6可以看出，随着提取时间的增加，更多的大豆异黄酮从豆粉中转移到提取溶媒中，当提取时间为4 h时，大豆异黄酮的提取量明显高于其他的提取时间，从而完成了大豆异黄酮从固相到液相的传质过程。

2.3 正交试验

以乙醇浓度、提取温度、提取时间、料液比四因素三水平正交试验结果，见表4。

表 4 正交试验因素水平表Table 4 Factor of the orthogonal test

从表4中极差R的数值可知，影响大豆异黄酮提取的各种因素其影响的强弱为：料液比>提取温度>乙醇的浓度>提取时间，即在各影响因素中，料液比对浸提率的影响较大。同时由正交试验确定出最佳提取条件，即采用70%乙醇、料液比1∶15（mg/mL），在80℃温度下回流搅拌浸提4 h，大豆异黄酮提取量达到最大值16.11 mg/g。

3 结论

1）以混合大豆异黄酮作为对照品测定豆粕中大豆总异黄酮的含量，线形良好，测量准确，同时又简化了分离过程中的有效成分的损失，更利于工业化的生产。

2）通过各因素的考察，确定豆粕中总大豆异黄酮的提取工艺优化条件，即经过脱脂后的豆粕在乙醇浓度为70%，料液比1∶15，提取温度80 ℃，提取4 h，分2次提取，第1次提取时间为3 h，第2次提取1 h时，提取效果最佳。但影响因素最大的是料液比、提取温度和乙醇的浓度。

[1]王兆梅,李琳.大豆异黄酮结构及其活性分析[J].天然产物研究与开发,2001,14(3):70-73

[2]Mcleod G S,Sheperd M J.Determination of the ionization constants of isoflavones by capillary electrophoresis[J].Phyto Anal,2000,11(5):322-326

[3]G Wang,S Kuan,O J Francis,et al.A simplified HPLC method for the determination of phytoestrogens in soybean and its processed products[J].Journal of Food Sci,1990,38(7):185-190

[4]蔡秋声.大豆异黄酮生理功能及其开发利用[J].粮食与油脂,1999,(2):31-35

[5]P D Delmas.Clinical use of biochemical markers of bone remodeling in osteoporosis[J].Bone,1992,13(4):17

[6]刘志胜,李里特,辰几应三.大豆异黄酮及其生理功能研究进展[J].食品工业科技,2000,21(1):78-80

[7]江英，邓辉.大豆异黄酮提取条件的研究[J].食品研究与开发,2004,25(3):67-68

Study on the Optimum Extraction of Soybean Isoflavones from Soybean Residue

LI Qin，DENG Xiu－xia，WANG Liu－liu，ZHAO Xiu－mei，LI Qi
（Inspection and Testing Centers，Zhengzhou City of Quality and Technical Supervision，Zhengzhou 450006，He'nan，China）

In order to obtain soybean isoflavones，the optimum extraction of soybean isoflavones from soybean residue was mainly studied.The best conditions were found by single factor test and orthogonal experiments.They included 70%ethanol of the extraction solvent，the soybean－to－solvent ratio of 1∶15（mg/mL），80 ℃ of the operation temperature，4 h（3 h＋1 h）of the extraction time，total extrated quality was 16.11 mg/g.

soybean is of lavones；soybean residue；optimum extraction；optimum；HPLC

李琴（1981—），女（汉），工程师，硕士研究生，研究方向：食品科学。

2011-04-19