双酶水解罗非鱼碎肉制备肉味香精前体物研究

杨建延，刘海英，过世东

(江南大学食品学院，江苏无锡214122)

目前，罗非鱼的加工方式以加工成鱼片为主，而剩余的骨架和碎肉等下脚料不能得到有效的利用，造成资源的浪费。本研究利用蛋白酶水解得到蛋白酶解液前体物制取肉味香精［1］。人们利用酶解法制备肉味香精已有不少的报道，酶解法相比传统的物理化学方法具有反应温和、能耗低、可控性强、污染少等优点［2］。利用多酶对肉类蛋白进行水解具有水解彻底、目标产物得率高、能得到氨基酸和小肽含量丰富的水解液［3］，制得的肉味香精摆脱了通过单酶水解制备肉味香精缺乏煲汤炖肉感和原汁原味感的缺陷［4］。本文通过木瓜蛋白酶，中性蛋白酶，复合蛋白酶分别与风味蛋白酶组合水解罗非鱼碎肉来探讨组合方式对肉味香精前体物的影响。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

冷冻罗非鱼鱼骨架 广西南宁百洋水产技术有限公司;中性蛋白酶 5.0×104U/g、木瓜蛋白酶5.0×104U/g 广西南宁庞博生物技术有限公司;复合蛋白酶7.0×104U/g、风味蛋白酶5.0×102LAPU/g

无锡雪梅酶制剂科技有限公司，各蛋白酶的作用特性见表1。

DSHZ-300多用途水浴恒温振荡床器 江苏太仓实验仪器厂;p H计 瑞士梅特勒-托利多公司;DL-5台式离心机 上海安亭科学仪器厂;Ag1100安捷伦液相色谱仪 美国安捷伦公司;Waters 600高效液相色谱仪 美国Waters公司。

1.2 实验方法

1.2.1 罗非鱼骨架碎肉制备 将冷冻的罗非鱼骨架常温下解冻，去鳍，去腮，清洗，用刀切成2cm长宽的方块，沥干备用。

1.2.2 蛋白酶酶解鱼骨架碎肉条件的单因素实验称取一定质量的蛋白酶，加入一定比例的水溶解，放入恒温振荡水浴锅升温至设定温度，再加入罗非鱼鱼骨架碎肉，调节pH，水解一定的时间，水解过程中间断的调节pH，水解完成后取出放入沸水浴中灭酶10m in。然后4000 r/m in转速下离心10min，取上清液待测。以温度、酶添加量、pH、水解时间为因素分别对四种蛋白酶进行单因素实验。

表1 各个蛋白酶的特点Table 1 The properties of protease

1.2.3 总氮测定 凯氏定氮法［5］。

1.2.4 氨基氮测定 电位滴定法［6］。

1.2.5 水解度计算方法 水解度的计算:水解度DH(%)=(水解后上清液氨基氮质量-水解前上清液氨基氮质量)/(样品中总氮质量-水解前上清液氨基氮质量)×100。

1.2.6 游离氨基酸测定方法 分析方法:OPAPMOC柱前衍生化。

色谱条件:色谱柱(250×4.6)mm，5μm;柱温40℃;流动相:A相:称取8.0g结晶乙酸钠于1000m L烧杯中，加入1000m L开水搅拌至所有结晶溶解，再加225μL三乙胺，搅拌并加5%的醋酸，将pH调到7.20±0.05，加入5m L四氢呋喃，混合后备用;B相:称取8.0g结晶乙酸钠于800m L烧杯中，加入400m L开水搅拌至所有结晶溶解，滴加2%的醋酸，将pH调到7.20±0.05，将此溶液加入800m L乙腈和800m L甲醇备用;流速1.0m L/m in;紫外检测器338、262nm(Pro，Hypro);梯度洗脱，洗脱程序见表2。

表2 氨基酸分析梯度洗脱表Table 2 The gradient elution table of amino acid analysis

1.2.7 肽分子量分布测定方法 色谱条件:色谱柱TSKgel2000 SWXL 300mm×7.8mm;流动相:乙腈/水/三氟乙酸(45/55/0.1，V/V/V);检测 UV220nm;流速0.5m L/m in;柱温30℃。样品制备:吸取样品2m L于10m L容量瓶中，用流动相稀释至刻度，用微孔过滤膜过滤后供进样。分子量校正曲线所用标准品:细胞色素 C(MW 12500)、抑肽酶(MW 6500)、杆菌酶(MW 1450)、乙氨酸-乙氨酸-酪氨酸-精氨酸(MW 451)、乙氨酸-乙氨酸-乙氨酸(MW 189);仪器操作方法及计算:操作参照中华人民共和国药典2000版，第二部附录VD;数据处理及计算由Waters M32 GPC软件自动进行。

表3 组合酶解酶作用条件及其水解度Table 3 Action conditions of double enzymes and their DH(%)

2 结果与分析

2.1 各蛋白酶作用条件对水解度的影响

从图1可以得出木瓜蛋白酶的最适作用条件为:酶添加量 1750U/g，水解时间 5h，pH6.5，温度50℃。从图2可以得出中性蛋白酶的最适作用条件为:酶添加量 2000U/g，水解时间 3h，pH7.0，温度50℃。从图3可以得出复合蛋白酶的最适作用条件为:酶添加量 1750U/g，水解时间 4h，pH7.5，温度50℃。从图4可以得出风味蛋白酶的最适作用条件为:酶添加量 20LAPU/g，水解时间 4h，pH 6.5，温度50℃。

由此可见上述几种蛋白酶作用条件温和，温度在50℃附近，最适作用 pH接近肉的天然 pH(5.5～6.5)。罗非鱼蛋白水解液的水解度随着酶的添加量的增加逐渐趋于饱和，如添加过多则会造成更多的浪费。随着水解时间的延长，水解度达到一定值后基本不再变化，主要是由于酶活力随着时间逐渐下降，且由于产物的累积对反应产生抑制作用［5］，它们都符合典型的酶的作用特点。

2.2 组合酶解对罗非鱼水解液品质的影响

根据风味蛋白酶和其他蛋白酶的最佳酶解条件，实验采用表3的酶解条件对罗非鱼碎肉进行酶解，从而探究组合酶解的效果。其中，酶添加量为各酶的饱和添加量，考虑到风味蛋白酶在6.5～7.0水解度相差不大且最高，木瓜蛋白酶+风味蛋白酶水解pH取6.5，中性蛋白酶+风味蛋白酶水解pH取7.0，复合蛋白酶+风味蛋白酶水解pH取7.0。温度都为50℃，料液比 1∶2，水解时间 4h。

2.2.1 组合酶解对游离氨基酸的影响 通过液相色谱对水解液的游离氨基酸进行检测分析，结果见表4。

由表3可知，木瓜蛋白酶+风味蛋白酶组合水解液的水解度偏小于后两组。从表4可知木瓜蛋白酶+风味蛋白酶组合的水解液氨基酸总量，含硫氨基酸，鲜味氨基酸，亲水性氨基酸以及疏水性氨基酸都明显高于其余两组。

图1 木瓜蛋白酶的酶添加量、水解时间、pH、温度对水解度的影响Fig.1 Effect of amount of papain，heating time，pH，temperature on the DH

氨基酸与还原糖的Maillard反应在香精中起到了重要的作用，它们对挥发性物质的生成有很大贡献。各单个的氨基酸与还原糖的反应产生不同的气味。目前检测到的挥发性物质包括吡嗪(煮熟的，烧烤的，烘焙谷物的气味)，烷基吡嗪(坚果的，烤的)，烷基吡啶(青草味的，涩的，苦味的)，吡咯(谷物味)，酰基吡啶(饼干味)，呋喃和呋喃酮(芳香味，烧焦味，辛辣味，焦糖味)，苯酚类(青草味，坚果味，芳香味)，噻吩(肉味)［7］。

图2 中性蛋白酶的酶添加量、水解时间、pH、温度对水解度的影响Fig.2 Effect of amount of neutral protease，heating time，pH，temperature on the DH

含硫氨基酸在Maillard反应中生成含硫化合物产生肉味，含硫氨基酸包括蛋氨酸和半胱氨酸，在Maillard反应过程中半胱氨酸非常活跃。半胱氨酸在Maillard反应过程中通过Strecker降解会形成硫化氢、氨和乙醛，它们又和Maillard反应过程中产生的羰基中间产物进一步反应，从而形成多种重要的风味化合物，如呋喃、吡嗪、吡咯、噻唑以及其它杂环化合物，对肉味风味具有重要贡献［3］。风味蛋白酶+木瓜蛋白酶组合酶解得到的罗非鱼蛋白水解液的含硫氨基酸高达13.06%，是一种很好的制备肉味香精的前体物;鲜味氨基酸在调味品中起到增强鲜味的作用，它们与核苷酸共同作用构成香精的鲜味，它们在Maillard反应前后的变化很小，可能因为它们是亲水性氨基酸的缘故。曾晓房等［8］发现在Maillard反应前后疏水性游离氨基酸的降解程度明显高于亲水性游离氨基酸。风味蛋白酶+木瓜蛋白酶组合酶解得到的罗非鱼蛋白水解液的鲜味氨基酸占到总的游离氨基酸的13.08%，疏水性氨基酸占到52.34%。这表明木瓜蛋白酶相较复合蛋白酶和中性蛋白酶能得到氨基酸的能力更强。综上所述，利用风味蛋白酶+木瓜蛋白酶组合水解得到的蛋白水解液得到更多的含硫氨基酸，鲜味氨基酸以及疏水性氨基酸，所以它是一种更好的肉味香精前体。

2.2.2 组合酶解对分子量分布的影响 通过液相色谱对水解液的分子量分布进行检测分析，结果见表5。

图3 复合蛋白酶的酶添加量、水解时间、pH、温度对水解度的影响Fig.3 Effect of amount of protamex，heating time，pH，temperature on the DH

由表5可知，三组水解液的肽分子量分布大体相似，差别不明显。他们的分子量范围97%以上的肽段分子量小于1000u，分子量在77%左右的肽段小于500u，分子量小于2000u的占到总体的99.5%左右。

曾晓房［8］通过胰蛋白酶制备的鸡骨架蛋白水解液中Mw＜1000u的肽段占总肽的79.45%，Mw＞5000u占8.91%，刘平［9］制备的大豆蛋白水解液中Mw＜1000u的肽段占总肽的78.36%，程林坤［10］制备的牛肉蛋白肽Mw＜1000u的肽段占总肽的67%，Mw＜500u占总肽的26.4%。而通过组合酶解制备的鱼肉水解液区别于很多的畜禽水解液和植物蛋白水解液，可能是跟鱼肉本身的蛋白种类和氨基酸组成有关系。

图4 风味蛋白酶的酶添加量、水解时间、pH温度对水解度的影响Fig.4 Effect of amount of flavourzyme，heating time，pH，temperature on the DH

肽广泛存在于食品中和蛋白酶解物中，而且被认为是食品中重要的风味增强剂和前体物。已有研究表明多种氨基酸和糖产生的风味和肽和糖产生的风味不是相似的，在Maillard反应中缺乏肽造成的风味缺陷是氨基酸所不能弥补的［11］。肽对于Maillard反应的机理至今不是很清楚，主要是由于分离技术的滞后造成的。肽在Maillard反应中在还原糖的存在下既存在本身的降解和交联，又直接与还原糖发生反应［12］。链长不同和结构不同的肽具有不同的滋味，主要包括酸味、甜味、苦味、鲜味、黄油味、牛肉味［11］。由于Stercker反应中氨基酸是必不可少的原料，所以肽或蛋白质在没有氨基酸存在的条件下对于Maillard反应挥发性物质的贡献很小，有研究表明肽通过形成环化二肽和吡嗪酮(烤香味，坚果味)这两种风味化合物对风味产生影响。原则上肽或蛋白质在热反应中会生成少量的氨基酸，但它们的作用微乎其微，另外还原糖的降解产物能与肽赖氨酸残基的ε-氨基发生反应，也能与精氨酸与色氨酸的侧链反应［13］。

Ogasawara［14］发现分子量介于 1000～5000u 的肽段对汤料的口腔饱满度、鲜味和持续性都有增强作用。小肽相对于大分子肽在Maillard反应中的活性要活泼很多。在Maillard反应中，各肽段的降解率与肽段分子量关系明显，肽段的分子量越小，降解率越大，分子量小于1000u的肽段降解率高达91.66%［15］。刘平［9］研究还原糖对大豆肽的降解和交联时发现，随着反应时间的延长，大豆肽在Maillard反应中反应程度加剧，糖促进了肽在Maillard反应中的交联与降解，其中 ＞5000u和 ＜1000u肽段在Maillard反应中均具有较高的反应活性，1000～5000u肽段的反应活性较低。所以通过组合酶解得到的水解液含有97%分子量小于1000u的肽段，是一种很好的香精前体物。

表4 组合酶解蛋白水解液的游离氨基酸含量Table 4 Free amino acids contents of hydrolysis acted by double enzymes

表5 组合酶解水解液的分子量分布情况Table 5 Molecular weight distribution of hydrolysis acted by double enzymes

3 结论

通过木瓜蛋白酶+风味蛋白酶组合水解得到的罗非鱼碎肉蛋白水解液氨基酸总量，含硫氨基酸，鲜味氨基酸以及疏水性氨基酸都显著高于中性蛋白酶+风味蛋白酶，复合蛋白酶+风味蛋白酶的组合;通过组合酶解得到的罗非鱼碎肉蛋白水解液的肽分子量小于1000u的肽段占到总量的97%以上。综上所述，利用木瓜蛋白酶+风味蛋白酶组合酶解罗非鱼碎肉制的水解液有望作为一种很好的肉味香精的前体物。

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