腹外侧视前区微量注射组胺对大鼠睡眠-觉醒周期的影响

刘宇炜，文若剑，陈晓青，易卉玲，黄　丹（江汉大学　医学院，湖北　武汉　430056）

腹外侧视前区微量注射组胺对大鼠睡眠-觉醒周期的影响

刘宇炜，文若剑，陈晓青，易卉玲，黄丹
（江汉大学医学院，湖北武汉430056）

摘要：目的研究组胺作用于腹外侧视前区对大鼠睡眠-觉醒周期的影响。方法通过脑立体定位、腹外侧视前区微量注射组胺，脑电图仪记录及分析睡眠、觉醒时相。结果微量注射50 μmol/L组胺无明显影响，而100 μmol/L组胺显著减少大鼠睡眠，增加觉醒。结论组胺在腹外侧视前区对大鼠睡眠-觉醒周期发挥重要的调节作用，具有明显的促觉醒作用。

关键词：组胺；腹外侧视前区；睡眠-觉醒周期

睡眠-觉醒周期是一种昼夜节律，乃机体生命之高级生理活动，是一个涉及多系统、多中枢的生理过程，具有复杂的神经调节机制［1］。其正常的周期性交替是人类生存的必要条件。在大脑内，下丘脑腹外侧视前区（ventrolateral preoptic area，VLPO）的神经元具有非常重要的促进睡眠作用［2］，其作用受到多种递质的影响。其中，组胺（histamine）发挥了重要的调节作用。组胺是一种广泛存在于动植物中的化学递质，又称为自身活性物质（或局部激素），其在微量情况下就能产生明显的生理活性［3］。笔者以前的研究表明，大鼠VLPO微量注射组胺可增加其运动活性，电生理实验研究也表明其作用可能是通过同时影响到VLPO两类神经元而引起［4］。

在本实验中，进一步采用脑立体定位仪，通过微量注射组胺，脑电图仪记录及分析睡眠、觉醒时相。实验结果证明，一定剂量的组胺作用于VLPO可显著减少大鼠睡眠，增加觉醒。

1　材料与方法

1.1材料

Sprague-Dawley大鼠，鼠龄20～30天，雌雄不限，由江汉大学医学院医学实验动物中心提供。

SN-2型脑立体定位仪（日本Tokyo Narishige），ND-82B八导脑电图仪（上海医疗器械厂）。

戊巴比妥钠（进口分装），临用前用蒸馏水配制成8 g/L溶液；组胺（histamine）购自Sigma公司，其余试剂为国产分析纯。

1.2方法

1.2.1动物手术参照文献［4］的实验方法，并在此基础上加以改进：大鼠经戊巴比妥钠（40 mg/kg）腹腔注射麻醉后，将头部固定于脑立体定位仪上。暴露颅骨，双氧水清洁颅骨表面。依据Paxinos和Watson大鼠立体定位图谱，将外径为0. 6 mm的不锈钢引导管插入到两侧VLPO上方1 mm处（AP-0. 24 mm；ML ±1. 0 mm；DV-8. 0 mm）。在冠状缝前2 mm及人字缝前1 mm与颅骨中线两侧旁开2 mm交叉点处分别安装铜质镀金螺丝钉，深度至穿透颅骨接触到硬脑膜，用于记录皮层脑电活动。在双侧颈肌肉内插入银丝电极以记录肌电活动。不锈钢引导管与记录电极均用牙科水泥固定于颅骨表面，并将电极通过电线连接到一个微型插座。术后休息1周。记录前将大鼠头部微型插座通过引导线连接到脑电图仪上，适应约24 h后开始记录。

1.2.2药物微量注射注射在清醒状态下进行，用针尖外径为0. 3 mm的微量注射器通过引导管缓慢向双侧VLPO内注射不同剂量药液（实验组）或生理盐水（对照组），并留针1min以上以防药液流出。

1.2.3睡眠描记及分析记录电极通过微型插座连接到ND-82B型八导脑电图仪上，同步记录脑电和肌电活动。每次描记从上午9点开始，连续记录4 h。以30 s为一分段时间，睡眠-觉醒周期分为：①觉醒期（W），以低压快速脑电（Electroencephalogram，EEG）和高肌电（electromyogram，EMG）为特征；②慢波睡眠（SWS），以高幅低频EEG为特征，EMG明显减少；③快速眼动睡眠（REM），以低幅高频EEG为特征，除偶尔肌肉抽动外，无明显EMG。总睡眠时间（TST）为SWS和REM之和。

1.3统计学分析

采用Sigmaplot 11.0（Jandel Scientific）和SPSS 16.0进行处理、统计分析和制图。实验结果以均值±标准差（±s）表示，统计结果采用配对t检验，P< 0. 05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1VLPO内微量注射组胺对大鼠睡眠-觉醒周期的影响

大鼠随机分为生理盐水（SAL）组、组胺（HIS）组。与SAL组相比较，VLPO内注射低浓度HIS（50 μmol/L/0. 2 μL/侧，n =8）对大鼠睡眠-觉醒周期无明显影响，而增加HIS浓度（100μmol/L/0. 2 μL/侧，n = 9）使大鼠W增加21. 8 ％（P < 0. 05），SWS、REM和TST分别减少13. 0％、2. 6％和12. 2％（P < 0. 05，P < 0. 05，P < 0. 05，见表1和图1）。

表1　微量注射组胺于腹外侧视前区对大鼠睡眠-觉醒周期的影响Tab. 1 Effects of microinjection of histamine in the ventrolateral preoptic area on rat sleep-wakefulness cycle（min，±s）

表1　微量注射组胺于腹外侧视前区对大鼠睡眠-觉醒周期的影响Tab. 1 Effects of microinjection of histamine in the ventrolateral preoptic area on rat sleep-wakefulness cycle（min，±s）

*：P < 0. 05（与对照组比较）。

分组　数量W SWS REM TST对照组90. 5±17. 2 HIS（50 μmol·L-1）93. 5±18. 6 HIS（100 μmol·L-1）78 9 110. 2±20. 8* 142. 8±20. 13. 8±1. 7146. 7±21. 5 139. 8±21. 53. 8±1. 6143. 9±20. 3 124. 3±18. 7*3. 9±1. 3128. 8±19. 8*

图1　微量注射组胺于腹外侧视前区对大鼠睡眠-觉醒周期的影响（min，±s）Fig. 1 Effects of microinjection of histamine in the ventrolateral preoptic area on rat sleep-wakefulness cycle（min，±s）

2.2VLPO内微量注射组胺对不同时段大鼠睡眠、觉醒成分的影响

进一步研究大鼠VLPO微量注射HIS后不同时间段对睡眠、觉醒成分的影响。与对照组比较，低浓度HIS组无影响；而高浓度HIS组第1小时无明显变化，从第2小时开始，第2、3、4小时，HIS组觉醒分别增加18. 2％、21. 8％和34. 8％（P < 0. 05，P < 0. 05，P < 0. 01，respectively），而睡眠则分别减少8. 9％、13. 7％ 和27. 2％（P < 0. 05，P < 0. 01，P < 0. 01，见图2）。

图2　微量注射组胺于腹外侧视前区对不同时段大鼠睡眠、觉醒成分的影响（min，±s）Fig. 2 Effects of microinjection of histamine in the ventrolateral preoptic area on sleep-wakefulness and TST of different duration（min，±s）

3　讨论

睡眠的目的是目前为止最难解的生物学迷团之一。尽管其功能尚无令人满意的解答，但对大脑控制睡眠-觉醒调节的研究已经取得了很大的进展。良好的睡眠可以帮助人体对抗感染，维持身体健康。充足的睡眠对认知功能的优化是必需的；相反，睡眠不足及障碍日益带来一系列的严重的社会与医学问题［2，5］。

睡眠-觉醒的调节涉及到众多的脑区，其中下丘脑腹外侧视前区的神经元具有非常重要的促进睡眠作用。这一区域的损毁会导致失眠。由于VLPO与主要的上行激活系统之间存在着非常复杂的交互抑制，得以精确地调控睡眠-觉醒过程。其中VLPO的GABA能神经元与结节乳头体核（tuberomamillary nu⁃cleus，TMN）组胺能神经元之间的交互抑制起着最核心的调节作用［6］。以前的研究认为组胺对VLPO神经元无作用［7］，但TMN组胺能神经元可以不间断地释放组胺到VLPO，VLPO组胺平均浓度在觉醒期最高（104 μmol/L），慢波睡眠时次之（35 μmol/L），REM阶段最低（22 μmol/L）。如果组胺在此区域不发挥任何兴奋或抑制作用，这可能有违常理。笔者前期的研究表明，大鼠VLPO微量注射组胺可增加其运动活性。电生理实验研究也表明其作用可能是通过同时影响到VLPO两类神经元而引起［4］。

本实验研究发现在大鼠VLPO注射低浓度HIS（50 μmol/L/0. 2 μL/侧）对大鼠睡眠-觉醒周期无明显影响，这可能是因为TMN组胺能神经元的不间断释放，VLPO始终存在组胺。当其浓度较低时，不足以影响睡眠-觉醒的转换；而增加HIS浓度（100 μmol/L/0. 2 μL/侧）使大鼠W增加21. 8％（P< 0. 05），SWS、REM和TST分别减少13. 0％、2. 6％和12. 2％（P< 0. 05，P< 0. 05，P< 0. 05），这可能是VLPO内组胺浓度升到一定高度后，可明显地对睡眠-觉醒周期产生调节作用。这与睡眠-觉醒的转换迅速、无过渡期的特点是相吻合的。

本研究的实验结果表明，微量注射组胺后，对不同时段的睡眠、觉醒成分作分析，发现低浓度条件下无作用；而增加组胺浓度后，其作用从第2小时开始明显，效果呈渐近性增加，到第4小时更加显著。笔者以前的电生理研究已经发现，100 μmol/L的组胺对VLPO的抑制作用可能部分通过兴奋其内的去甲肾上腺素兴奋型神经元，进而释放GABA而抑制去甲肾上腺素抑制型神经元而实现的［4］。其反应会形成一种正反馈，形成持续的清醒状态［6］，这和本研究的实验结果是一致的。

综上所述，组胺在腹外侧视前区对睡眠-觉醒周期发挥重要的调节作用，在较低浓度时，对睡眠/觉醒的转换无明显作用；而在各种因素作用下大量释放时，可产生快速、明显而持久的促觉醒作用。其效果可能通过复杂的调控而维持正常的睡眠-觉醒节律及快速转换，具体的机制还有待进一步的研究。

参考文献（References）

［1］张景行，章功良.睡眠-觉醒机制研究概况［J］.中国现代神经疾病杂志，2006，6（1）：11-16.

［2］VETRIVELAN R，SAPER C B，FULLER P M. Armodafinil-induced wakefulness in animals with ventrolateral preoptic lesions ［J］. Nat Sci Sleep，2014，6：57-63.

［3］PANULA P，SUNDVIK M，KARLSTEDT K. Developmental roles of brain histamine［J］. Trends Neurosci，2014，37（3）：159-168.

［4］LIU Y W，LI J，YE J H. Histamine regulates activities of neurons in the ventrolateral preoptic nucleus［J］. J Physiol，2010，588（Pt 21）：4103-4116.

［5］RICHTER C，WOODS I G，SCHIER A F. Neuropeptidergic control of sleep and wakefulness［J］. Annu Rev Neurosci，2014，37：503-531.

［6］BROWN R E，BASHEER R，MCKENNA J T，et al. Control of sleep and wakefulness［J］. Physiol Rev，2012，92（3）：1087-1187.

［7］GALLOPIN T，FORT P，EGGERMANN E，et al. Identification of sleep-promoting neurons in vitro［J］. Nature，2000，404 （6781）：992-995.

（责任编辑：范建凤）

Effects of Microinjection of Histamine in Ventrolateral Preoptic Area on Rat Sleep-Wakefulness Cycle

LIU Yuwei，WEN Ruojian，CHEN Xiaoqing，YI Huiling，HUANG Dan
（School of Medicine，Jianghan University，Wuhan 430056，Hubei，China）

Abstract：Objective To study the effect of histamine in rat ventrolateral preoptic area on sleep-wakeful⁃ness cycle. Methods Histamine was microinjected into ventrolateral preoptic area through stereotaxic technique，sleeping and waking time phases were recorded and analyzed by electroencephalograph. Results Microinjection of 50 μmol/L histamine had no significant effect，but 100 μmol/L histamine de⁃creased sleeping time and increased waking time significantly. Conclusion Histamine is involved in reg⁃ulation of sleep-waking cycle and promotes wakefulness significantly in the ventrolateral preoptic area.

Keywords：histamine；ventrolateral preoptic area；sleep-wakefulness cycle

作者简介：刘宇炜（1973—），男，副教授，博士，研究方向：神经生物学。

基金项目：国家自然科学基金面上项目（31371090）；武汉市科技计划项目（201250499145-27）

收稿日期：2014-10-27

DOI：10.16389/j.cnki.cn42-1737/n.2015.01.014

中图分类号：R338.8

文献标志码：A

文章编号：1673-0143（2015）01-0084-04