H2S对烟雾吸入肺损伤大鼠的抗氧化作用研究

韩志海，张燕，段蕴铀，姜毅，王晓阳，方庭正，黄燕

·短篇报道·

H2S对烟雾吸入肺损伤大鼠的抗氧化作用研究

韩志海，张燕，段蕴铀，姜毅，王晓阳，方庭正，黄燕

烟雾吸入损伤；氧化性应激；硫化氢

1 资料与方法

1.1 实验动物及分组 清洁级健康成年雄性SD大鼠24只，体重150～250g，由军事医学科学院实验动物中心[SCXK-(军)-2012-0004]提供，海军总医院实验动物中心[SCXK-(军)-2012-0012]饲养。按照随机化原则将动物分为对照组、烟雾组、烟雾+H2S 3h组、烟雾+H2S 6h组，每组6只。

1.2 实验方法 按照本课题组已成功建立的方法进行大鼠烟雾吸入性肺损伤模型制作，烟雾组、烟雾+H2S 3h组、烟雾+H2S 6h组各取2只大鼠分别置入吸烟瓶中，至出现呼吸深慢、张口喘鸣时或满2min时限时，停止烟雾吸入，立即敞开吸烟瓶口，使其吸入空气7min。重复上述步骤3～5次，至大鼠吸入空气7min仍旧昏迷不醒时结束。

在烟雾吸入后，烟雾+H2S 6h组大鼠予以6h持续吸入H2S 80mg/L+30%O2，烟雾+H2S 3h组大鼠予以3h持续吸入H2S 80mg/L+30%O2，对照组、烟雾组予以吸入30% O26h。实验结束大鼠予以安乐死，分离肺叶，右肺上、下叶分别置液氮冻存，右肺中叶4%多聚甲醛溶液浸泡72h后常规石蜡包埋。

1.3 ELISA检测 采用双抗体夹心ABC-ELISA法检测右肺下叶匀浆中谷胱甘肽(GSH)、γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶(γ-GCS)浓度，具体步骤按试剂盒说明操作。

1.4 免疫组化法检测右肺中叶肺组织NF-κBp65、Nrf2(nuclear factor-E2 related factor)含量 右肺中叶肺组织石蜡切片厚度3μm，60～65℃烤片4h，脱蜡，水化，PBS洗涤，高压修复组织抗原，3%H2O2灭活过氧化物酶，正常山羊血清封闭，分别滴加第一抗体anti-NF-κBp65 antibody (Abcam，ab16502)、Anti-Nrf2 antibody (Abcam，ab31163)各50μl，稀释至1:200，4℃孵育过夜，PBS洗3次，滴加复合二抗HRP-Polymer anti Mouse/Rabbit IgG(Maixin.Bio，KIT-5020)，室温静置20min；DAB显色，苏木精复染。阴性对照以血清代替一抗。镜检黄色或棕黄色染色判为阳性。应用Image Pro Plus 6.0图像分析系统(美国Media Cybernetics公司)进行半定量分析，IPP6.0软件分析得出每个视野阳性染色的平均光密度(mean density)、积分光密度(integrated optical density，IOD)的总和即累积光密度(sum IOD)，计算出每个标本上述指标的均值，从而对染色结果进行半定量分析。

1.5 肺组织γ-GCS mRNA的定量检测 采用荧光定量PCR法检测大鼠右肺上叶γ-GCS mRNA。引物由嘉美生物技术有限公司设计合成，上游5'-GCATTC ATTTCACCCTGTTCT-3'，下游5'-ACAAAGAGCCC TGACCTAATG-3'，扩增产物长度132bp。用超纯RNA提取试剂盒(CWbio.Co.Ltd，Cat#CW0581)提取组织样本总RNA。用HiFi-MMLVc DNA第一链合成试剂盒(CWbio.Co.Ltd，Cat#CW0744)进行反转录，用Ultra SYBR Mixture(with Rox)(CWbio. Co.Ltd，Cat#CW0956)进行扩增。反应条件为：95℃ 10min；95℃ 15s，60℃ 60s，40个循环。采用2–ΔΔCt法计算产物的相对含量。

1.6 统计学处理 采用SPSS 18.0软件进行统计分析，计量资料以±s表示，多组间比较采用单因素方差分析，进一步两两比较采用LSD-t检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 肺组织匀浆检测结果 烟雾组大鼠肺组织匀浆中GSH浓度较对照组明显降低(P<0.001)，烟雾+H2S 3h组与烟雾+H2S 6h组GSH浓度较烟雾组明显降低(P<0.001)。烟雾组大鼠γ-GCS浓度较对照组明显升高(P<0.01)，烟雾+H2S 3h组与烟雾+H2S 6h组γ-GCS浓度与烟雾组比较差异无统计学意义(P>0.05)。烟雾组γ-GCS mRNA的相对表达量较对照组明显增高(P<0.001)，烟雾+H2S 3h组与烟雾+H2S 6h组γ-GCS mRNA的相对表达量较烟雾组明显降低(P<0.001，表1)。

2.2 大鼠肺组织Nrf2及NF-κBp65的免疫组化检测及半定量分析结果 烟雾组大鼠肺组织Nrf2平均光密度与累积光密度较对照组明显增高(P<0.05)，烟雾+H2S 3h组及烟雾+H2S 6h组较烟雾组明显降低(P<0.05)。烟雾组大鼠肺组织NF-κBp65的累积光密度较对照组明显增高(P<0.001)，烟雾+H2S 3h组及烟雾+H2S 6h组较烟雾组明显降低(P<0.05)，烟雾+H2S 3h组与烟雾+H2S 6h组比较差异无统计学意义(P>0.05，表2)。

表1 大鼠肺组织匀浆GSH、γ-GCS、γ-GCS mRNA含(±s，n=6)Tab. 1 Concentration of GSH, γ-GCS, γ-GCS mRNA in rat lung tissue (±s, n=6)

表1 大鼠肺组织匀浆GSH、γ-GCS、γ-GCS mRNA含(±s，n=6)Tab. 1 Concentration of GSH, γ-GCS, γ-GCS mRNA in rat lung tissue (±s, n=6)

(1)P<0.01 compare with smoking group; (2)P<0.01 compare with control group

表2 大鼠肺组织NF-κBp65、Nrf2免疫组化检测及半定量结果(±s，n=6)Tab. 2 Immunohistochemically detected the relative expression of NF-κBp65 and Nrf2 in rat lung tissue (±s, n=6)

表2 大鼠肺组织NF-κBp65、Nrf2免疫组化检测及半定量结果(±s，n=6)Tab. 2 Immunohistochemically detected the relative expression of NF-κBp65 and Nrf2 in rat lung tissue (±s, n=6)

(1)P<0.05 compare with smoking group; (2)P<0.05 compare with control group

3 讨 论

本研究中烟雾组Nrf2及γ-GCS mRNA的表达、γ-GCS浓度均较对照组明显增高，提示烟雾吸入后抗氧化应激体系激活，以对抗氧化应激损伤；烟雾+H2S 3h组及烟雾+H2S 6h组Nrf2、γ-GCS mRNA的表达较烟雾组降低，但γ-GCS的浓度与烟雾组比较无明显变化，GSH浓度较对照组明显降低，提示吸入H2S可抑制机体自身的抗氧化体系，推测原因为H2S作为强还原性物质，经气道吸入后可与氧化剂发生中和反应，直接参与抗氧化应激反应，从而抑制机体自身的抗氧化体系[1]。H2S至少能与超氧阴离子、过氧化氢、超氧化氮及次氯酸四种氧自由基发生反应[2-3]，保护膜结构免受自由基的损伤。H2S通过蛋白质巯基化机制，抑制机体抗氧化体系的过度激活，从而减少能量消耗，为机体度过急性损伤期保存能量。

[1]Liu YF, Tang HW, Wu XL, et al. Reproduction and evaluation of a rat model of inhalation lung injury caused by black gunpowder smog[J]. Med J Chin PLA, 2013, 38(8): 670-674. [刘一凡, 唐红卫, 吴小利, 等. 黑火药烟雾致吸入性肺损伤大鼠模型的建立与评价[J]. 解放军医学杂志, 2013, 38(8): 670-674.]

[2]Krupa A, Fudala R, Stankowska D, et al. Anti-chemokine autoantibody: chemokine immune complexes activate endothelial cells via IgG receptors[J]. Am J Respir Cell Mol Biol, 2009, 41(2): 155-169.

[3]van der Heijden M, van Nieuw Amerongen GP, Koolwijk P, et al. Angiopoietin-2, permeability oedema, occurrence and severity of ALI/ARDS in septic and non-septic critically ill patients[J]. Thorax, 2008, 63(10): 903-909.

R563.9

A

0577-7402(2015)05-0425-02

10.11855/j.issn.0577-7402.2015.05.20

2015-03-27；

2015-04-15)

(责任编辑：沈宁)

全军“十二五”医学科研课题(CWS11J180)

100048 北京 海军总医院呼吸内科(韩志海、张燕、段蕴铀、王晓阳、方庭正、黄燕)；110032 沈阳 沈阳军区政治部门诊部(姜毅)

张燕，E-mail: changyan511@sohu.com