日本鹌鹑艾美尔球虫人工感染试验及内生发育研究

张 敏， 齐 萌， 李志勇， 王 聪， 王 芳， 马超锋， 张龙现， 菅复春， 宁长申

(1.焦作市动物疫病预防控制中心，河南 焦作 454003； 2.河南农业大学牧医工程学院，河南 郑州 450002； 3.焦作市畜牧工作站，河南 焦作 454003； 4.河南新正好生物工程有限公司，河南 郑州 450002； 5.信阳市动物疫病预防控制中心，河南 信阳 464000)



日本鹌鹑艾美尔球虫人工感染试验及内生发育研究

张 敏1， 齐 萌2， 李志勇1， 王 聪3， 王 芳4， 马超锋5， 张龙现2， 菅复春2， 宁长申2

(1.焦作市动物疫病预防控制中心，河南 焦作 454003； 2.河南农业大学牧医工程学院，河南 郑州 450002； 3.焦作市畜牧工作站，河南 焦作 454003； 4.河南新正好生物工程有限公司，河南 郑州 450002； 5.信阳市动物疫病预防控制中心，河南 信阳 464000)

为研究日本鹌鹑艾美尔球虫(Eimeriauzura)内生发育过程及致病性，人工接种8日龄鹌鹑1.0×105个日本鹌鹑艾美尔球虫孢子化卵囊。研究结果发现，日本鹌鹑艾美尔球虫在鹌鹑体内潜隐期为5 d，显露期为13 d，发病率为70.3%，死亡率为7.5%，增重明显受到影响.组织切片观察发现，日本鹌鹑艾美尔球虫主要寄生于鹌鹑十二指肠和空肠前段，内生发育过程经三代裂殖生殖阶段和一个配子生殖阶段，接种后102 h达到裂殖生殖阶段高峰期，接种后114 h达到配子生殖阶段高峰期，感染后120 h形成卵囊；所有内生阶段均在肠上皮细胞内发育。日本鹌鹑艾美尔球虫寄生可引起鹌鹑十二指肠上皮细胞发生轻度颗粒变性、坏死，黏膜固有层有大量炎性细胞浸润，充血出血. 试验结果表明，日本鹌鹑艾美尔球虫对鹌鹑有中等致病性。

艾美尔球虫；内生发育；裂殖生殖；配子生殖

球虫病是一种对鹌鹑危害严重的常见寄生虫病，给养鹑业带来较大的经济损失[1]。已报道的鹌鹑球虫有16种，但有关鹌鹑球虫内生发育和致病性研究报道较少，国外研究者对鹌鹑巴氏艾美尔球虫(Eimeriabateri)、莱泰艾美尔球虫(E.lettyae)和原尾艾美尔球虫(E.procera)的生活史、生物学特性和致病性进行了研究[2-5]。杨芷云等[6]通过人工感染试验对角田氏艾美尔球虫(E.tsunodai)在鹌鹑体内发育过程和致病性进行了观察。国内鹌鹑球虫感染主要以巴氏艾美尔球虫和日本鹌鹑艾美尔球虫(E.uzura)为主[1、7]，RAO等[8]通过动物感染试验发现，接种1.0×105个日本鹌鹑艾美尔球虫卵囊的3日龄日本鹌鹑，死亡率为6.6%。本研究旨在采用单卵囊感染、继代扩增获得的日本鹌鹑艾美尔球虫孢子化卵囊感染8日龄雏鹑，对日本鹌鹑艾美尔球虫内生发育过程和致病性进行研究，以期为鹌鹑球虫病的防控提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 试验用卵囊

河南农业大学兽医寄生虫学实验室经雏鹑单卵囊扩增的日本鹌鹑艾美尔球虫卵囊，孢子化后于2.5%重铬酸钾溶液中4 ℃保存，定容至1.0×106个·mL-1，保存时间不超过40 d。

1.2 试验动物及分组

1日龄朝鲜龙城系鹌鹑公雏150只，购自河南省焦作市武陟县某鹌鹑孵化场。动物房采用高锰酸钾和甲醛熏蒸法消毒，笼具经火焰喷灯消毒。用饱和食盐溶液漂浮法连续检查7 d，状态良好、粪便检查球虫卵囊阴性的鹌鹑供试验用。 8日龄雏鹑随机分为3组，其中第Ⅰ组60只为病理变化观察组，第Ⅱ组40只为临床症状观察组，第Ⅰ组和第Ⅱ组雏鹑每只经嗉囊接种1.0×105个孢子化日本鹌鹑艾美尔球虫卵囊，第Ⅲ组40只为不感染对照组。 各试验组雏鹑分别隔离饲养，喂全价料，自由饮水。

1.3 临床观察

接种后每日观察并记录各组雏鹑的精神状态，饮食状况，粪便性状和发病、死亡情况等，每日分组收集粪样，采用饱和食盐溶液漂浮法进行粪便学检查。感染前及试验结束时对临床症状观察组和不感染对照组鹌鹑逐只称重，计算平均体重和增重。

1.4 病变观察和取样

接种卵囊后，每6 h随机剖杀病理变化观察组2只雏鹑，观察其肠、肾、肝和脾等组织器官病变，至粪便检查发现卵囊时不再剖杀。取剖杀后雏鹑脏器和肠道组织，包括十二指肠、空肠、回肠、盲肠和直肠，各取2段，样品置10%中性福尔马林固定液中，常温保存备用。采用石蜡包埋切片法进行组织切片，常规苏木精-伊红(H-E)染色后，置OLYMPUS光学显微镜下观察并拍照。

2 结果与分析

2.1 临床症状

感染组雏鹑接种卵囊后，大部分于感染后(Days Post Infection，DPI) 4 d表现精神沉郁，食欲减退、饮欲增加，出现粪便稀薄，血便，持续至感染后第8天，期间出现死亡；临床症状观察组40只雏鹑发病率为70.3% (29/40)，死亡率为7.5% (3/40)；不感染对照组雏鹑精神状态始终良好，粪便性状正常，未出现死亡情况。 病理变化观察组和临床症状观察组雏鹑均于感染后第5天在粪便中查到卵囊，日本鹌鹑艾美尔球虫潜隐期为5 d，显露期为13 d，不感染对照组未见卵囊排出。

2.2 雏鹑增重情况

接种卵囊前(DPI 0)，临床症状观察组和不感染对照组雏鹑平均体重分别为15.4、15.3 g，试验结束时(DPI 17)，临床症状观察组和不感染对照组雏鹑平均体重分别为47.8、59.4 g，增重分别为32.4、44.1 g。

2.3 内生发育观察

日本鹌鹑艾美尔球虫内生发育阶段虫体主要寄生于鹌鹑十二指肠和空肠前段，接种后102 h达到裂殖生殖阶段高峰期，接种后114 h达到配子生殖阶段高峰期，接种后120 h形成卵囊。

2.3.1 裂殖体和裂殖子 日本鹌鹑艾美尔球虫裂殖体主要寄生于十二指肠绒毛上皮细胞内，接种后12 h可见子孢子侵入细胞，形成分界不清晰呈紫色的核。接种后24～48 h第1代裂殖体逐渐成熟，形状不规则，平均大小为4.8 μm (2.6～6.6 μm)×3.8 μm(2.6～5.2 μm)，含有3～5个分界清晰的紫色核。接种后42 h可见数量极少的第1代裂殖子，一个带虫空泡中有数个呈新月形的裂殖子，平均大小为4.5 μm (2.4～6.3 μm)×1.2 μm(0.8～1.5 μm)。接种后60 h产生第2代裂殖体，内含5～10个核，形状不规则，平均大小为4.5 μm (2.8～6.5 μm)×3.9 μm(2.1～5.2 μm) (图1-A)。接种后66 h 1个第2代裂殖体产生5～10个第2代裂殖子，平均大小为2.0 μm (1.8～2.4 μm)× 1.0 μm (0.8～1.3 μm)。接种后90 h开始产生第3代裂殖体，接种后96 h裂殖体数量明显增多，形状规则，多呈长椭圆形或圆形，平均大小为7.0 μm (3.9～12.9 μm)×5.2 μm (3.9～7.7 μm) (图1-B)。接种后96 h产生呈香蕉形的第3代裂殖子，接种后102 h达到裂殖生殖阶段高峰期，裂殖子平均大小为2.8 μm (2.2～3.5 μm)×1.4 μm (1.0～1.0 μm) (图1-C)。

2.3.2 配子体和配子 接种后108～120 h在十二指肠和空肠前段肠腺上皮细胞及固有膜中可观察到处于不同发育时期的配子体。大、小配子体均由裂殖体发育而来，大配子体细胞逐渐增大，胞浆颜色随之变淡，同时在细胞质中形成界限清晰的嗜酸性颗粒，至大配子体成熟时，嗜酸性颗粒聚集到细胞膜内层，大配子体大小为(7.7～18.1) μm×(5.2～12.9) μm，在发育过程中，细胞中央始终含1个紫色核(图1-D)。早期小配子体细胞质呈紫红色，随着发育，小配子体细胞逐渐增大，出现愈来愈多界限清晰紫色的核，逐渐向细胞膜移动，细胞中央只有少量的核及絮状残体，小配子体大小为(2.6～7.7)μm×(2.6～7.2)μm，成熟小配子为长丝状或新月状，呈均紫色(图1-E)。配子生殖阶段，可见大量裂殖体和裂殖子同时存在(图1-F)。

A. 接种后60 h十二指肠上皮细胞内第2代裂殖体 (×1 000)； B. 接种后96 h十二指肠上皮细胞内成熟的第3代裂殖体 (×1 000)； C. 接种后102 h十二指肠上皮细胞内第3代裂殖子 (×1 000)； D. 接种后108 h十二指肠上皮细胞内成熟的大配子体 (×1 000)； E. 接种后108 h十二指肠上皮细胞内成熟的小配子体 (×1 000)； F. 接种后114 h十二指肠上皮细胞内成熟的第3代裂殖体和成熟的大配子体 (×1 000)； G. 接种后114 h十二指肠上皮细胞内的卵囊 (×400)； H. 十二指肠黏膜固有层大量炎性细胞浸润 (×400)； I. 十二指肠局部出血 (×1 000)

A. The second generation meront in the epithelial cells of duodenum at 60 h post-infection (×1 000); B. The third generation meront in the epithelial cells of duodenum at 96 h post-infection (×1 000); C. The third generation merozoite in the epithelial cells of duodenum at 102 h post-infection (×1 000); D. Mature macrogametocyte in the epithelial cells of duodenum at 108 h post-infection (×1 000); E. Mature microgametocyte in the epithelial cells of duodenum at 108 h post-infection (×1 000); F. Mature third generation meront and macrogametocyte in the epithelial cells of duodenum at 114 h post-infection (×1 000); G. Oocysts in the epithelial cells of duodenum at 114 h post-infection (×400); H. A large number of inflammatory cell infiltration in the mucosa lamina propria of duodenum (×400); I. Local hemorrhage in duodenum (×1 000)

图1 日本鹌鹑艾美尔球虫内生发育及病理变化

Fig.1 Observation of endogenous development stages and pathological changes ofE.uzura

2.3.3 卵囊 大配子体与小配子结合后，形成合子，细胞内层的颗粒聚合形成囊壁，孢子体充满整个卵囊，内有大量细小淡紫色颗粒和一个细胞核。感染后114～120 h可在肠内容物和肠道上皮细胞中观察到卵囊，感染后120 h可从粪便中检查到卵囊(图1-G)。

2.4 病理变化

日本鹌鹑艾美尔球虫引起的病变主要集中于鹌鹑十二指肠及空肠前段。感染后6～84 h，虫体处于裂殖生殖阶段初期，肠绒毛和肠腺上皮细胞基本保持完整，无明显肉眼可见病变，期间粘膜涂片上见未完全分化的裂殖体和成熟裂殖体，也可见未成熟的裂殖子和数量较少的成熟单个裂殖子存在。接种后90～108 h，开始出现较为明显的病变，十二指肠肠壁增厚，粘膜表面有出血点，粘膜涂片上见大量成熟裂殖体，内含较多裂殖子。切片可见十二指肠及空肠前段肠绒毛上皮细胞发生轻度颗粒变性、坏死，黏膜固有层有大量炎性细胞浸润，有出血和充血现象(图1-H，图1-I)。接种后108～120 h，切片可见大量裂殖体、配子体和合子，亦可见少量卵囊，宿主上皮细胞中寄生多个虫体，肠绒毛轻度萎缩。其他组织器官未见病变，也未观察到内生发育阶段的虫体。

3 讨论

3.1 日本鹌鹑艾美尔球虫对雏鹑的致病性

TSUNODA等[9]报道用1.0×105个日本鹌鹑艾美尔球虫卵囊接种3日龄日本鹌鹑，DPI5～8时出现腹泻和贫血，本次试验发现1.0×105个日本鹌鹑艾美尔球虫卵囊接种8日龄朝鲜龙城系鹌鹑，DPI4～9时出现粪便稀薄和血便，无明显贫血症状。RAO等[8]试验发现3日龄日本鹌鹑接种1.0×105个日本鹌鹑艾美尔球虫卵囊后观察至第6周，雏鹑3周内死亡率为6.6%，3～6周无死亡，感染组和不感染组雏鹑平均体重增重分别为136.9、144.8 g；RUFF等[3]报道用5.0×105个日本鹌鹑艾美尔球虫(占65%)和角田氏艾美尔球虫(占35%)混合卵囊感染3日龄和17日龄日本鹌鹑时，死亡率分别100%和8%，表明随着鹌鹑年龄增长，球虫致死率显著降低。本次试验发现DPI4～9雏鹑死亡率为7.5%，试验结束时(DPI17)不感染对照组平均增重明显高于临床症状观察组。 NORTON等[10]用1.28×106个巴氏艾美尔球虫卵囊接种幼龄日本鹌鹑，仅出现轻微的食欲减退、粪便稀薄、体重减轻等临床症状；而杨芷云等[6]用角田氏艾美尔球虫卵囊接种8日龄鹌鹑时，1.0×103个卵囊即可致鹌鹑死亡。据本试验结果，日本鹌鹑艾美尔球虫致病力较角田氏艾美尔球虫弱，但比巴氏艾美尔球虫强。

3.2 日本鹌鹑艾美尔球虫寄生部位内生和发育过程

通过粘膜涂片观察，日本鹌鹑艾美尔球虫内生发育阶段主要在十二指肠；组织切片观察，日本鹌鹑艾美尔球虫裂殖生殖及配子生殖阶段，虫体主要寄生于鹌鹑十二指肠绒毛上皮细胞中，空肠前段亦有少量虫体寄生，寄生部位肠绒毛上皮细胞发生颗粒变性和坏死，固有层有大量炎性细胞浸润，肠道局部轻微出血和充血。根据观察结果发现，日本鹌鹑艾美尔球虫在朝鲜龙城系鹌鹑内生发育过程中可进行3代裂殖生殖，与BASHTAR等[11]对日本鹌鹑进行的球虫内生发育过程相一致。成熟裂殖体最早出现于感染后24 h，直到感染后102 h均可见处于不同发育时期的裂殖体。根据成熟裂殖体的形状及裂殖体中所含裂殖子数量的多少，日本鹌鹑艾美尔球虫存在2种类型的裂殖体。第1种成熟于感染后24～60 h，形状不规则，每个裂殖体中含数个裂殖子；第2种成熟于感染后90～102 h，形状规则，呈椭圆形或圆形，每个裂殖体中含数十个甚至上百个裂殖子；据出现时间推算，前者为第1代和第2代裂殖体，后者为第3代裂殖体。

3.3 日本鹌鹑艾美尔球虫内生发育过程中有世代并存现象

观察组织切片时，发现有世代混杂现象，即有性繁殖与无性繁殖的虫体同时存在，切片中可同时见到第3代裂殖体、大配子体、小配子体和卵囊。葛亮[12]观察自然感染菲莱氏盲肠温扬球虫的内生殖虫体时，组织切片中可同时见到三型裂殖体、大配子体、小配子体和卵囊；RUFF等[3]试验感染发现，日本鹌鹑艾美尔球虫和角田氏艾美尔球虫在鹌鹑体内内生发育阶段参差不齐，发育上具有不同步现象；刘梅等[13]研究发现鹅球虫在鹅体内的内生性发育过程中，至少经过2个世代的裂殖生殖，其内生阶段世代并存现象不明显。通常速发型子孢子侵入肠道上皮细胞后就开始发育成滋养体，继之发育成为裂殖体、配子体和卵囊；而迟发型子孢子侵入肠道上皮细胞后，要经过一段或长或短的休眠期后才发育为滋养体；球虫子孢子在宿主体内不同步发育造成了内生殖阶段存在不同世代并存现象。

[1] 索 勋. 禽球虫病[M]. 北京:中国农业出版社, 2004.

[2] BHATIA B B, PANDEY T P, PANDE B P.Eimeriabaterin. sp. from Indian common grey quail (Coturnixcoturnixcoturnix) [J]. Indian J Microbiol, 1965, 5: 61-64.

[3] RUFF M D. Life cycle and biology ofEimerialettyae, sp.n. (Protozoa: Eimeriidae) from the northern bobwhite, Colinus virginianus [J]. J Wildlife Dis, 1985, 21: 361-370.

[4] GERHOLD R W, GUVEN E, MCDOUGALD L R. Oocyst production ofEimerialettyaein northern bobwhites following low-dose inoculations [J]. J Parasitol, 2011, 97(3):525-526.

[6] 杨芷云, 王宗仪, 庄国昌. 鹌鹑角田氏艾美尔球虫的研究[J]. 河北农业大学学报, 1990, 13(2): 58-61.

[7] 林昆华, 王 维, 汪 明. 鹌鹑巴氏艾美耳球虫的形态学研究[J]. 中国兽医杂志, 1991, 17(11):6-7.

[8] RAO J R, SHARMA N N, JOHRI T S. Influence of dietary aflatoxin onEimeriauzurainfection in Japanese quail (Coturnixcoturnixjaponica) [J]. Vet Parasitol, 1995, 56(1-3):17-22.

[9] TSUNODA L, MURAKI Y. A new coccidium of Japanese quails: Eimeria uzura n.sp [J]. Japan J Vet Sc, 1971, 33: 227-235.

[10]NORTON C C, PIERCE M A. The life cycle ofEimeriabateri(Protozoa: Eimeriidae) in the Japanese quailCoturnixjaponica[J]. J Protozool, 1971, 18: 57-62.

[11]BASHTAR A R, ABDEL-GHAFFAR F, ALRASHEID K A,et al. Light microscopic study onEimeriaspecies infecting Japanese quails reared in Saudi Arabian farms[J]. Parasitol Res, 2010, 107(2):409-416.

[12]葛 亮. 龙海麻鸭自然感染菲莱氏盲肠温扬球虫亚种(Wenyonellaphiliplevineicaecum)内生殖虫体与组织病变[J]. 厦门大学学报：自然科学版, 1999, 38(6): 931-936.

[13]刘 梅, 戴亚斌, 李文良, 等.鹅球虫Eimeriafulva的生活史及其感染引起的组织病理变化观察[J].中国兽医学报, 2006, 26(4):376-378.

(责任编辑：蒋国良)

Experimental infection and endogenous development stages ofEimeriauzurain Japanese quail

ZHANG Min1， QI Meng2， LI Zhiyong1， WANG Cong3， WANG Fang4， MA Chaofeng5，ZHANG Longxian2， JIAN Fuchun2， NING Changshen2

(1.Jiaozuo Animal Disease Prevention and Control Center, Jiaozuo 454003, China； 2.Engineering College of Animal Husbandry and Veterinary Science, Henan Agricultural University, Zhengzhou 450002, China； 3.Jiaozuo Animal Husbandry Station, Jiaozuo 454003，China； 4.Henan Xinzhenghao Biological Engineering Co.， Ltd., Zhengzhou 450002, China； 5.Xinyang Animal Disease Prevention and Control Center, Xinyang 464000, China)

For the study ofEimeriauzuraendogenous development stages and pathogenicity, 8-day-old artificially-reared coccidian-free quails were inoculated orally with 1.0×105of sporulated oocysts ofE.uzura. The results show that the prepatent period was 5d and discharge of oocysts continued for 13 d. The incidence and mortality rate were 70.3% and 7.5%, respectively. The weight gain was affected significantly. Observation by tissue section showed thatE.uzuraparasitized mainly in the epithelial cells of duodenum and anterior jejunum. There were three merogony stages and one gamogony stage in the life ofE.uzura. The merogony and gamogony stage ofE.uzurapeaked at about 102 h and 114 h post-infection, respectively. The time of formingE.uzuraoocysts was at about 120 h post-infection. All endogenous stages developed in intestinal epithelial cells.E.uzuracould cause mild granular degeneration and necrosis in epithelial cells of the duodenum and a large number of inflammatory cell infiltration, congestion and hemorrhage in mucosa lamina propria. The results showed thatE.uzurawas medium pathogenic for quails.

Eimeriauzura; endogenous development; merogony; gamogony

2014-06-22

农业部国家现代肉羊产业技术体系建设专项(nycytx-39)

张 敏(1980-)，女，河南温县人，兽医师，硕士，从事动物疫病防控方面的研究。

宁长申(1958-)，男，河南郾城人，教授，博士生导师。

1000-2340(2015)03-0363-05

S852.723

A