一例豚鼠铜绿假单胞杆菌和马链球菌兽疫亚种混合感染的诊断

余思义　项玉　金陶等

摘要：对一只突发死亡的宠物豚鼠进行病理学检查、细菌分离培养及鉴定。结果表明，该豚鼠为铜绿假单胞杆菌和马链球菌兽疫亚种的混合感染。豚鼠易携带人畜共患病病菌，人们在饲养应该重视人畜共患病，及时控制人畜共患病的传播，防止其成为人类疾病传染源。

关键词：豚鼠；马链球菌兽疫亚种；铜绿假单胞杆菌；混合感染

中图分类号：S865.1+1 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2015）19-4783-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.19.032

Abstract：In China， pets have become a growing industry with huge consumer groups. And， it is well known， humans are fond of getting long with pets. However， pets are most likely to become the source of animal-borne disease with a potential threat to human health. This study focus on one Guinea pig， as a pet， died suddenly within a few days. The pathological examnation， bacteria isolation and identification， and animal experiment were used to research it. Results indicated that this Guinea Pig was co-infected with streptococcus equi subsp. zooepidemicus and pseudomonas aeruginosa. To the best of our knowledge， humans should attend the zoonoses when feed Guinea Pig due to it is easily carrying zoonoses pathogen， and timely prevent the dissemination of pathogen which has a potential hazard to humans.

Key words： guinea pigs； Streptococcus equi subsp. zooepidemicus； Pseudomonas aeruginosa； co-infection

马链球菌兽疫亚种，过去称为兽疫链球菌，普遍存在于动物的黏膜，尤其是马属动物的皮肤、上呼吸道黏膜、扁桃体及生殖道等处，可致各种家畜的炎症和败血症[1]。铜绿假单胞杆菌又称铜绿假单胞菌，广泛分布于土壤、水、空气以及动物肠道和皮肤上，具有多种致病因子而且有强侵袭力，能广泛侵袭机体各个器官组织，引起化脓性肺炎、子宫炎、肉芽肿和肠炎等各种病变和炎症。能感染众多哺乳动物、禽类和爬虫类。其极易产生耐药性且耐药机制复杂[2-4]。

近年来，人们对于豚鼠的利用逐渐的多元化。作为试验动物，用于疾病诊断、生物制品制备及科学研究；由于形象可爱，也成为宠物之一；又因其肉质美味，成为餐桌上的美食。豚鼠与人们的生活联系日益密切，频繁的出现在人类的生活中[5]。鼠类更易携带病原菌，其与人类接触，容易导致人畜共患病的发生[6，7]，因此人们需要深入研究豚鼠容易携带的病菌以及病原的流行病学，有效预防及控制人畜共患病的发生。

1 材料与方法

1.1 材料

TSA培养基、TSB培养基（均购于BD公司），无支原体胎牛血清（购于浙江天杭生物科技有限公司）；生化鉴定管（购于杭州微生物试剂有限公司）；蛋白酶K购自博能生物科技有限公司；核酸分子量标准物（购自宝生物工程大连有限公司），dNTP、 Mixes、TaqDNA Polymerase（购自Fermentas公司）；GoldView TM（购自庄盟公司）。

1.2 方法

1.2.1 豚鼠发病状况及病理学检查 该病例为人工饲养的宠物豚鼠，品种名为荷兰猪，饲养过程中发病死亡，询问了解发病情况，对死亡豚鼠进行病理剖检，观察病理变化，并取眼睑、心脏、肝脏、肺、大脑、小脑、胃、爪、肾、肠管、胰等组织器官备用。

1.2.2 病原菌的分离与培养 取眼睑、心脏、肝脏、肺、脑组织，采用无菌操作方法，用接种环划线接种在TSA血清平板和麦康凯平板上，置于37 ℃温箱中，24～48 h后，观察细菌生长情况。

挑取典型菌落传代接种于TSA血清平板上，观察细菌生长情况，并取典型的单个菌落做细菌涂片，革兰氏染色镜检，观察纯培养菌的形态特征。

1.2.3 病原菌的生化试验 将纯化后的细菌按常规方法接种于侧金盏花醇、赖氨酸、鸟氨酸、氨基酸对照、苯丙氨酸、半固体琼脂、尿素、硫化氢、乳糖、马尿酸钠、木糖、棉子糖、葡萄糖、枸橼酸盐、葡磷胨水（M.R、V.P）、山梨醇、葡萄糖酸盐生化鉴定管，37 ℃培养24～48 h后，观察结果。

1.2.4 病原菌的16S rRNA序列测定及分析 设计并合成引物，上游引物R：5'-GAGTTTGATCMTGGCTCAG-3'，下游引物F：5'-CTAHAGGGTATCTAATCCT-3'。

按常规方法将菌体接种于血清TSA培养基上，37 ℃培养24 h，用生理盐水收集菌体，使用细菌基因组DNA提取试剂盒（上海天根生化科技有限公司），按说明书进行基因组DNA提取。

把提取的细菌基因组DNA作为模板，采用25 μL反应体系： Taq PCR Master Mix 12.5 μL、漂洗液pw 9.5 μL、DNA模板1 μL、上游引物1 μL、下游引物1 μL。反应条件：95 ℃复性5 min；94 ℃复性1 min，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，共35个循环；72 ℃延伸8 min，4 ℃保存。经1%琼脂糖凝胶电泳鉴定后，取未纯化的PCR产物送上海英骏生物科技有限公司测序。

1.2.5 分离菌对小鼠的致病性观察 用灭菌生理盐水配制分离菌的细菌浓度为2×109 CFU/mL菌悬液备用。

成年小鼠24只，经血液检查无细菌感染后，随机分为3组，每组8只，试验1组和2组分别经腹腔和肌肉途径注射2种分离菌菌悬液，每只0.5 mL。对照组经相同的途径接种0.5 mL灭菌生理盐水。常规饲养管理。

感染后观察记录试验小鼠的临床症状、死亡时间和死亡数，对死亡的小鼠立即进行剖检，取心、肝部位做细菌分离鉴定，观察死亡小鼠的病理变化。

2 结果与分析

2.1 感染豚鼠的发病情况

某人工饲养宠物豚鼠在几天之内出现精神沉郁症状，眼部有乳白色脓性分泌物，红肿（图1），迅速消瘦而死。

豚鼠死亡后剖检可见心脏上有白色斑块（图2），肺脏呈暗红色，表面可见红色斑点，切面湿润多汁（图3），其他组织器官未见明显异常。

对心肌等组织的病理学检查显示心肌可见坏死灶，心肌细胞核碎裂、溶解，心肌细胞间有炎性细胞浸润（图4），血管周围间隙增宽，亦有炎性细胞浸润，其间混有大量蓝色细菌凝块（图5）；肺脏的肺泡壁增厚，血管扩张，有些肺泡腔内有大量红细胞（图6），有的肺泡腔内有巨噬细胞，肺脏血管周围也可见炎性细胞浸润（图7）。眼睑增厚，眼睑组织内有大量以单核细胞、中性粒细胞为主的炎性细胞聚集（图8、图9）；其他器官组织未见异常变化。

2.2 病原菌的分离鉴定

采用常规细菌分离培养方法，从肝脏、心脏、眼睑和脑组织中，分离到2株细菌，其中一株在TSA培养基上呈浅绿色荧光的圆形菌落；在麦康凯培养基上生长迅速，呈乳白色的黏稠、凸起菌落，该菌经染色镜检显示为革兰氏阴性杆菌。另一株在TSA培养基上为圆形，光滑湿润，直径约为0.5～1.0 mm的半透明菌落，经革兰氏染色镜检，为革兰氏阳性球菌。

2.3 病原菌的生化试验

分离的革兰氏阳性球菌对葡萄糖、乳糖、山梨醇、尿素、精氨酸、赖氨酸试验阳性，甘露醇、枸橼酸盐、鸟氨酸、苯丙氨酸、丙二氨酸、甲基红、靛青质、V-P试验、产H2S、硝酸盐还原试验为阴性，可液化明胶。

分离的革兰氏阴性杆菌对葡萄糖、甘露醇、枸橼酸盐、尿素、阿拉伯胶糖、氧化酶试验阳性，对乳糖、麦芽糖、蔗糖、棉子糖、菊糖、V-P试验、MR试验、产H2S试验为阴性，可液化明胶。

2.4 病原菌的16SRNA的PCR鉴定结果

将提取的菌体DNA做PCR扩增，经1%的琼脂糖凝胶电泳后得到一段750 bp的核苷酸片段。测序结果用Blast分析与GenBank上的已知序列进行同源性比较，根据不同属细菌16 S rRNA基因同源性为70%～90%，而同一种内不同株间基因同源性大于99%，确定分离的革兰氏阴性杆菌为铜绿假单胞杆菌，革兰氏阳性球菌为马链球菌兽疫亚种。

2.5 分离菌对小鼠的致病性试验结果

铜绿假单胞杆菌组小鼠在注射后第二天，腹腔注射和肌肉注射组均全部死亡，死亡小鼠心脏、肝脏、肺和肾脏均表现有淤血变化，未见其他异常变化。自心脏和肝脏分离到铜绿假单胞杆菌。

马链球菌兽疫亚种组小鼠在注射后第三天，腹腔注射和肌肉注射组均全部死亡，死亡小鼠心脏、肝脏、肺和肾脏均表现有淤血变化，未见其他异常变化。从心脏和肝脏分离到马链球菌兽疫亚种。

3 讨论

本研究自死亡豚鼠体内分离到2种细菌，经细菌分离纯化、生化试验及细菌的基因测序等系列鉴定，2种细菌为马链球菌兽疫亚种和铜绿假单胞杆菌。从死亡豚鼠的临床症状及病理特征来看，发病豚鼠有眼睑的化脓性炎症、坏死性心肌炎及肺脏的出血，与铜绿假单胞杆菌眼部感染的特征相符[8，9]。从动物试验结果看，分离菌均可引起试验小鼠死亡，综上所述，可以判定该豚鼠为以上两种菌的混合感染。

据文献报道，在外观健康的豚鼠的鼻腔和眼结膜可隐性携带马链球菌兽疫亚种[10，11]。当动物采食粗饲料擦伤口腔黏膜或当鼻咽部的分泌物偶然呛进气管时，病菌趁机侵入体内，到达局部淋巴结引起感染。

铜绿假单胞杆菌广泛分布于土壤、水、空气以及动物肠道和皮肤上。以往通常以为该菌为致病力较弱的条件致病菌，但目前的研究均证实该菌能产生内毒素、致死毒素、肠毒素、溶血素、杀白细胞素及多种胞外酶等多种致病因子，具有强侵袭力，为完全致病菌[3，4]。

宠物在中国已经成为一个日渐壮大的产业和庞大的群体。宠物与人类朝夕相处，最容易成为动物源性疾病的传染源，各种病原菌通过宠物生理性的呼吸、唾液、脱落的上皮细胞及被毛、粪便以及病理表现如咳嗽、流鼻涕、呕吐、腹泻等直接或者间接的传染给人类，尤其老人和儿童是最易感染的群体[12]，对人类健康造成潜在威胁。

改善宠物饲养管理条件，确保饲料和饮水清洁卫生，保持圈舍的清洁和干燥，严格搞好动物粪尿、污物的无害化处理，对宠物进行定期预防接种疫苗等[13]。同时，也建议宠物饲养爱好者尽量避免饲养鼠类宠物，因为鼠类携带的人畜共患病病毒极多，而且易对人类健康造成极大的隐患，比如目前在美国甚为流行的猴痘（Monkeypox），鼠类就是其重要携带传染源[14]。

参考文献：

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