口腔血管瘤组织中TIP30／CC3基因的表达及意义

陈忠辉

（新疆兵团第五师八十六团南区医院，博乐833414）

血管瘤是由血管形成异常而引起的疾病。50%以上发生于头颈部。口腔颌面血管瘤是颌面外科常见的一种良性血管肿瘤，虽然大多数血管瘤能自发消退，但是一些血管瘤病变可严重损坏正常组织，并产生并发症［1］，往往给患者及其家人带来极大痛苦。但关于血管瘤的发病机制，目前还未明了，这对于血管瘤的临床治疗也是目前急待解决的关键问题。

TIP30（Tat interacting protein 30）基因是新近发现的一种肿瘤抑制基因，可抑制肿瘤细胞的增殖和转移侵袭，促进肿瘤细胞的凋亡，抑制肿瘤血管的生成。它在多种肿瘤组织中的表达明显减少，如黑色素瘤、胃癌、恶性胶质细胞瘤、乳腺癌和肝细胞癌等，序列分析发现TIP30蛋白与肿瘤转移抑制基因CC3基因为同一蛋白。近年来的研究表明，TIP30参与细胞调控，促进肿瘤细胞凋亡［2］、抑制肿瘤新生血管生成［3］以及抑制骨桥蛋白［4］等，从而抑制肿瘤的浸润与转移。表明TIP30／CC3基因的表达失调与肿瘤之间存在密切关系。

研究应用免疫组织化学方法和图像分析技术检测了口腔血管瘤及正常周围组织中TIP30／CC3基因表达水平，探讨TIP30／CC3基因在口腔血管瘤发生、发展过程中的表达变化，为临床上治疗口腔血管瘤提供实验依据。

材料和方法

1材料

1.1 材料来源 收集新疆兵团第五师医院病理科2008－2013年口腔血管瘤存档蜡块20例，其中男性15例，女性5例。这些血管瘤所在的部位主要为颌面部。患者术前均未做任何辅助性治疗。

1.2 材料分组 将所有标本进行免疫组织化学S－P法检测增殖细胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen，PCNA），按 Mulliken分类标准并结合PCNA的表达进行分组：石蜡标本中增生期血管瘤12例，退化期血管瘤8例。另取距癌组织5cm外的周围正常颌面部组织5例作对照。

1.3 主要试剂 即用型鼠抗人PCNA单克隆抗体、鼠抗人TIP30／CC3单克隆抗体（购于北京中杉生物技术有限公司）；超敏即用型SP通用型免疫组织化学试剂盒（购于福州迈新公司）；DAB显色试剂盒及多聚赖氨酸（购于北京中杉生物技术有限公司）。

2方法

2.1 免疫组织化学SP法检测TIP30／CC3和PCNA相关抗原

具体步骤：（1）4μm组织切片常规脱蜡入水；（2）抗原修复（柠檬酸缓冲液微波抗原修复法）；（3）滴加3%H2O2，37℃湿盒孵育10min以抑制内源性过氧化物酶活性；（4）正常羊血清37℃湿盒孵育10min以减少非特异性背景；（5）分别滴加一抗；（6）滴加链霉素抗生物素蛋白－过氧化物复合物37℃湿盒孵育；（7）滴加新鲜配置的DAB显色液显色；（8）苏木素复染；（9）梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封片并镜检；（10）用PBS代替一抗作为阴性对照组，购买的阳性片作为TIP30／CC3的阳性对照组，人正常皮肤组织作为PCNA的阳性对照组。

2.2 免疫组织化学结果判断

（1）TIP30／CC3以细胞膜或胞浆出现棕黄色颗粒为阳性反应，PCNA以细胞核出现棕黄色颗粒为阳性反应。阴性对照组除细胞核染成蓝色外，应无棕黄色反应物。

（2）采用HPIAS－1000高清晰度彩色病理图文报告管理系统（同济千屏影像公司）对TIP30／CC3的表达进行定量分析，每张切片随机选取5个完整而不重叠的高倍镜视野（×400），测定每个视野下阳性反应的平均光密度、阳性反应面积和所有细胞总面积，计算阳性面积率。以每例5个视野的平均光密度、阳性面积率的平均值作为该例的测量值。（阳性面积率＝单位面积中阳性反应的总面积／单位面积中细胞的总面积×100%）

3.统计学处理 数据以均数±标准差表示，用SPSS11.5软件对各组免疫组织化学反应阳性颗粒的平均光密度、阳性面积率做单因素方差分析和SNK（q）检验，检验水准α为0.05。

结 果

1 PCNA的表达

增生期血管瘤内皮细胞核肥大，核内弥漫分布棕黄色颗粒，PCNA表达强（图1）；退化期血管瘤内皮细胞核扁平，胞核内有少量棕黄色颗粒，PCNA表达弱（图2）。

2 TIP30／CC3的表达

增生期血管瘤内皮细胞膜或胞浆内有少量的棕黄色颗粒，TIP30／CC3呈低表达（图3）；退化期血管瘤内皮细胞胞膜或胞浆内有较多棕黄色颗粒，TIP30／CC3呈高表达（图4）；正常皮肤组织内皮细胞膜或胞浆内有较多棕黄色颗粒，TIP30／CC3呈高表达（图5）。图像分析结果见表。增生期组TIP30／CC3的表达明显低于退化期组和正常组织（P＜0.05），而后两组比较差异无统计学意义（P＞0.05）（表1）。

讨 论

血管瘤以内皮细胞异常增长为其特点，血管内皮细胞在血管瘤的发生发展过程中发挥重要作用，而血管内皮细胞生长受制一系列正调控因子和负调控因子的调节［5－7］。一般认为血管内皮细胞的增殖与消退是血管瘤生长和消退的关键原因。近年来的许多研究表明，内皮细胞增殖和凋亡是血管瘤增生、消退的病理组织学基础，内皮细胞凋亡是血管瘤自然消退的关键所在。

TIP30是一种30KD的Tat结合蛋白，又称为HTATIP2 （HIV1Tat interactive protein 2），是Xiao H 等［8］通过研究人类免疫缺陷病毒（Human immunodeficiency virus，HIV ）的体外转录时发现的。TIP30作为HIV转录的辅助因子可以和Tat结合蛋白相互结合从而提高HIV的增殖。通过序列分析发现TIP30和肿瘤抑制基因CC3为同一蛋白。经研究发现TIP30/CC3在多种肿瘤组织中的表达率明显降低，如乳腺癌、肝细胞癌、黑色素瘤、恶性胶质细胞瘤、结肠癌等，证明TIP30／CC3的下调与肿瘤的发生存在密切关系［9－15］。其主要机制是通过抑制血管的生成和促进细胞的凋亡来实现的。

表1 口腔血管瘤不同时期TIP30／CC3表达的平均光密度和阳性面积率（）Table 1 The average optical density and the rate of TIP30／CC3positive area in different period of human dermal hemangiomas（）

表1 口腔血管瘤不同时期TIP30／CC3表达的平均光密度和阳性面积率（）Table 1 The average optical density and the rate of TIP30／CC3positive area in different period of human dermal hemangiomas（）

＊增生期组与退化期组比较，P＜0.05；（Comparison between proliferatinghemangiomas and involuting hemangiomas）＊P＜0.05；△退化期组与正常组比较，P＞0.05；（Comparison betweeninvoluting hemangiomas and normal skin tissue）△P＞0.05；▲正常组与增生期组比较，P＞0.05（Comparison between proliferatinghemangiomas and normal skin tissue） ▲P＞0.05

Groups例数N平均光密度Average Optical Density组别Rate of Positive Area 阳性面积率Involuting Group正常组 5 0.2980±0.0324▲ 0.2859±0.0318▲Normal Grou＊Proliferating Group退化期组 8 0.2868±0.0323△ 0.2788±0.0316△增生期组 12 0.0804±0.0104＊ 0.0721±0.0103 p

研究结果显示：口腔血管瘤增生期组织中TIP30／CC3基因的表达明显低于退化期血管瘤和正常口腔粘膜组织（P＜0.05）。肿瘤的发生是一个复杂的过程，是多因素、多基因发生改变所造成的。我们实验的结果显示：抑癌基因TIP30/CC3可能通过促进血管瘤内皮细胞的凋亡参与血管瘤的退化过程，表明TIP30表达失调可能与口腔血管瘤的发生和发展密切相关。血管瘤是一种血管生成控制失去平衡而引起的疾病，为研究恶性肿瘤血管生成提供了一个良好的模型。血管生成是多种调节因子共同参与相互作用的结果，健康状态下，机体通过这些因子的完美平衡来控制血管生成。研究这些因子在血管瘤形成过程中的表达可以为研究肿瘤的血管生成提供参考和指导，通过了解这些调节因子在肿瘤血管生成中的作用，为抑制肿瘤的血管生成提供理论和方法学依据。

因此，进一步研究TIP30基因与血管瘤其它生物学指标的关系及其相互作用机制，将有助于了解血管瘤发病的分子生物学机制，进而指导临床治疗。今后的实验中我们将进一步探索TIP30基因在多种肿瘤组织表达降低的机制，涉及到哪些分子调控通路，并希望通过基因或蛋白水平的干预来阻断其分子调控通路，为今后多种肿瘤的生物治疗提供实验依据。

［1］Jinnin M，Ishihara T，Boye E，et al.Recent progress in studies of infantile hemangioma.The Journal of Dermatology，2010，37（4）：283－298

［2］Li X，Zhang Y，Cao S，et al.Reductio，of TIP30correlates with poor prognosis of gastric cancer patients and its restoration drastically inhibits tumor growth and metastasis.Int J Cancer，2009，124（3）：713－721

［3］Chen X，Dong W，Luo S，et al.Expression of TIP30 tumor suppressor gene is down－regulated in human colorectal carcinoma.Dig Dis Sci，2009，55（83）：2219－2226

［4］Sonveaux P.Loss of CC3／TIP30allows tumor cells to cope with low glucose.Cell Cycle，2011，10（3）：376－381.

［5］Shan G，Tang T，Zhang D.Expression of HLA－G inhemangioma and its clinical significance.J Huazhong Univ Sci Technolog Med Sci，2012，32（5）：713－718

［6］ZHONG S，YANG G，XIA C.Expression of HLA－G in hemangioma and its clinical significance.J Huazhong Univ Sci Technolog Med Sci，2009，29（5）：614－619

［7］Stiles JM，Rowntree RK，Amaya C，et al.Gene expression analysis reveals marked differences in the transcriptome of infantile hemangioma endothelial cells compared to normal dermalmicrovascular endothelial cells.Vasc Cell，2013，25；5（1）：6

［8］Xiao H，Tao Y，Greenblatt J，et al.A cofactor，TIP30，specifically enhances HIV－1Tat－activated transcription.Proc Natl Acad Sci U S A，1998Mar 3，95（5）：2146－2151

［9］Li A，Zhang C，Gao S，et al.TIP30loss enhances cytoplasmic and nuclear EGFR signaling and promotes lung adenocarcinogenesis in mice.Oncogene，2013，32（18）：2273－2281

［10］Zhang C，Li A，Zhang X，et a1.A novel TIP30protein complex regulates EGF receptor signaling and endocytic degradation.J Biol Chem，2011，286（11）：9373－9381

［11］Chen V，Shtivelman E.CC3／TIP30regulates metabolic adaptation of tumor cells to glucose limitation.Cell Cycle，2010，9（24）：4941－4953

［12］Fong S，King F，Shtivelman E.CC3／TIP30affects DNA damage repair.BMC Cell Biol，2010，7（11）：23－32

［13］Chen X，Cao X，Dong W，et a1.Jin Y.Expression of TIP30tumor suppressor gene is down－regulated in human colorectal carcinoma.Dig Dis Sci，2010，55（8）：2219－2226

［14］Tong X，Li K，Luo Z，et a1.Decreased TIP30expression promotes tumor metastasis in lungcancer.Am J Pathol，2009，174（5）：1931－1939

［15］Zhang H，Zhang Y，Duan HO，et a1.TIP30is associated with progression and metastasis of prostatecancer.Int J Cancer，2008，123（4）：810－816

图 版 说 明

图1 增生期血管瘤PCNA的表达

增生的内皮细胞核内弥漫分布棕黄色颗粒（→），PCNA表达强，S－P×200

图2 退化期血管瘤PCNA的表达内皮细胞核内有少量棕黄色颗粒（→），PCNA表达弱，S－P×200

图3 增生期血管瘤TIP30／CC3的表达增生期血管瘤内皮细胞膜或胞浆内有少量的棕黄色颗粒，TIP30／CC3呈低表达（→），S－P×200

图4 退化期血管瘤TIP30／CC3的表达退化期血管瘤内皮细胞胞膜或胞浆内有较多棕黄色颗粒，TIP30／CC3呈高表达（→），S－P×200

图5 正常对照组TIP30／CC3的表达正常皮肤组织内皮细胞膜或胞浆内有较多棕黄色颗粒，TIP30／CC3呈高表达（→），S－P×200

EXPLANATION OF FIGURES

Fig.1PCNA expression in proliferating hemangiomas SP ×200

Fig.2PCNA expression in involuting hemangiomas SP ×200

Fig.3TIP30／CC3expression in proliferating hemangiomas SP×200

Fig.4TIP30／CC3expression in involuting hemangiomas SP×200

Fig.5TIP30／CC3expression in normal skin tissue SP ×200