萌芽-低温打浆技术制备高苷元类异黄酮豆乳粉

江连洲，寻崇荣，吴长玲，普拉谢克夫·亚历山大·尤里耶维奇，范志军，李 杨，许振国，王中江,*

（1.东北农业大学食品学院，黑龙江 哈尔滨 150030；2.克麦罗沃国立大学，俄罗斯 克麦罗沃州 620034；3.黑龙江省北大荒绿色健康食品有限责任公司，黑龙江 哈尔滨 150036；4.山东省高唐蓝山集团总公司，山东 聊城 252800）

豆乳粉中含有丰富的蛋白质、脂肪酸等营养物质及大豆低聚糖、大豆异黄酮、大豆卵磷脂等功能性成分，易于人体消化吸收，深受消费者的喜爱。研究表明异黄酮具有抗氧化、抗真菌、抗溶血等功效，可预防癌症、心血管疾病及骨质疏松等疾病的发生，缓解女性更年期症状。因此，开展高含量异黄酮豆乳粉的研究非常必要[1-4]，目前，制备豆乳粉最常用的是传统湿法工艺，其过程一般是将大豆浸泡后进行热烫、磨浆、分离、煮浆处理，再经浓缩、均质及喷雾干燥制得豆乳粉，但传统豆乳粉加工过程会破坏异黄酮等活性成分，导致豆乳粉的功能性价值降低。

目前，有研究表明萌芽处理可提高大豆异黄酮含量及其活性，且可在一定程度上降低大豆中抗营养因子（胰蛋白酶抑制剂、脂肪氧化酶、植酸及植物凝集素）的含量[2,5]。王莘等[6]测定了萌芽绿豆的异黄酮含量，结果表明萌芽39 h后的绿豆异黄酮含量最高，增加了54.8%。翟玮玮等[7]对黑豆进行发芽处理，结果表明黑豆在发芽50 h后，异黄酮的葡糖苷形式含量减少，苷元形式含量增加，抗氧化性增强。申海进等[8]利用0.05%的硫酸铵溶液浸泡以促进大豆发芽，与未发芽大豆相比，异黄酮含量增加53.6%。包萨日娜等[9]利用正交试验对发芽大豆异黄酮含量进行工艺优化，结果发现在25 ℃、相对湿度90%培养条件下浸泡时间16 h，大豆中异黄酮含量最高。因此，本研究以发芽大豆为原料，以提高豆乳粉异黄酮含量及其抗氧化活性。

豆乳粉中的异黄酮只有消化吸收后，其抗氧化等生物活性才可高效表达。有研究表明，人体可直接消化利用异黄酮的苷元形式（黄豆苷元、染料木素和黄豆黄素），而异黄酮的β-葡萄糖苷形式（大豆苷、染料木苷及黄豆黄素苷）、丙二酰基葡萄糖苷形式（丙二酰基大豆苷、丙二酰基染料木苷、丙二酰基黄豆黄素苷）和乙酰基葡萄糖苷形式（乙酰基大豆苷、乙酰基染料木苷、乙酰基黄豆黄素苷）需通过β-葡萄糖苷酶降解去糖基后才可被人体利用，β-葡萄糖苷酶可将β-糖苷异黄酮转化为苷元异黄酮，但β-葡萄糖苷酶在人体中无法合成，因此需要增加豆乳粉中异黄酮的苷元形式以改善异黄酮的消化利用率[10-13]。Góesfavoni等[14]在制备脱脂大豆粉的预处理阶段，将大豆子叶去皮，于50 ℃浸泡12 h，得到富含苷元异黄酮的脱脂大豆粉。马玉荣[10]、Kao[15]和Lima[16]等研究表明大豆异黄酮的组成及含量与浸泡时间及温度有关，水热处理可增加β-葡萄糖苷酶活性，提高大豆苷元类异黄酮的含量。因此本研究在传统湿法加工的基础上，利用低温打浆（即在低温下进行磨浆处理）技术代替传统磨浆工艺，防止β-葡萄糖苷酶失活，促进β-糖苷的转化，以制备高苷元类异黄酮豆乳粉。

目前，已有利用萌芽提高大豆异黄酮含量、低温浸泡原料大豆提高豆乳粉中异黄酮含量的研究报道，但将萌芽-低温打浆技术应用到高苷元类异黄酮豆乳粉加工中的研究鲜见报道。本实验以传统湿法加工技术制备豆乳粉为基础，利用萌芽-低温打浆技术以提高豆乳粉中高苷元类异黄酮含量，通过响应面法对萌芽-低温打浆工艺进行优化，以得到高苷元类异黄酮豆乳粉；对豆乳粉中异黄酮含量及组成与传统湿法加工得到的豆乳粉进行对比分析，为高苷元类异黄酮豆乳粉的生产加工提供实验支撑。

1 材料与方法

1.1 材料

大豆 哈尔滨九三油脂集团；大豆磷脂 周口慧洋饲料有限公司；12 种大豆异黄酮标准品 成都曼思特生物科技有限公司；实验所需基础试剂（均为分析纯）北京化学试剂公司。

1.2 仪器与设备

JMS-50胶体磨（3 000 r/min） 通益机械有限公司；Ultra-Turrax T25高速分散器 德国IKA公司；喷雾干燥机无锡昂益达机械有限公司；AL204型分析天平 梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司；XW-80A旋涡混合器上海青浦沪西仪器厂；THZ-80水浴锅 江苏电子有限公司；LW-1600FC紫外-可见分光光度计 上海菁华科技仪器有限公司；PHS-3C雷磁pH计 上海精密科学仪器有限公司；BUCHI R-100旋转蒸发仪 北京世贸远东科学仪器有限公司；ACQUITY超高效液相色谱系统沃特世科技（上海）有限公司。

1.3 方法

1.3.1 豆乳粉的制备

黄豆→筛选→浸泡→萌芽→热烫→低温打浆→浆渣过滤分离→大豆磷脂调配→浓缩→均质→喷雾干燥→豆乳粉

参考申海进[8]和Baú[12]等的方法，称量500 g黄豆，用0.05%的硫酸铵溶液浸泡12 h（料液比1∶3（g/mL），浸泡温度5 ℃），水洗2 次以去除残留浸泡液。参照Paucar-Menacho等[17]的方法对浸泡后的大豆进行萌芽处理，沸水热烫5 min，低温打浆（即低温磨浆，调节料液比为1∶7（g/mL），转速3 000 r/min），过滤除去浆渣，煮浆[10]（120 ℃，10 min），混入2%的乳化剂大豆磷脂，真空浓缩（浓缩至固形物质量分数为15%左右即可），15 MPa均质5 min后，喷雾干燥（进口温度185 ℃、出口温度85 ℃）即得豆乳粉样品。对照组传统湿法工艺不进行大豆萌芽处理，弱碱水磨浆工艺参数为料液比1∶7（g/mL）、pH 6.5～7.0、温度90 ℃、时间55 min，其他条件与上述一致。

1.3.2 萌芽工艺的单因素试验

保持低温打浆工艺参数：pH 6.0、温度55 ℃、时间3 h，在其他条件不变的情况下，以萌芽温度25 ℃、萌芽时间60 h为固定工艺，分别选取萌芽温度为15、20、25、30、35 ℃，萌芽时间为20、40、60、80、100 h进行单因素试验。通过苷元类异黄酮含量分析确定萌芽工艺单因素最优条件。

1.3.3 低温打浆工艺的单因素试验

保持萌芽工艺参数为萌芽温度25 ℃、萌芽时间60 h，在其他条件不变的情况下，以浆液pH 6.0、打浆温度55 ℃、打浆时间3 h为固定工艺，分别选取浆液pH值为5.0、5.5、6.0、6.5、7.0，打浆温度为45、50、55、60、65 ℃，打浆时间为1、2、3、4、5 h进行单因素试验。通过苷元类异黄酮含量分析确定低温打浆工艺单因素条件。

1.3.4 萌芽-低温打浆工艺的响应面试验

在单因素试验结果的基础上，以苷元类异黄酮含量为考察指标，利用Design-Expert软件进行响应面试验优化结果分析，选取萌芽温度、萌芽时间、浆液pH值、打浆温度、打浆时间5 个因素为自变量，以苷元类异黄酮含量为响应值，设置5因素3水平试验，因素与水平如表1所示。

表1 响应面试验的因素与水平Table 1 Independent variables and their coded values tested in response surface methodology

1.3.5 苷元类异黄酮含量的测定

1.3.5.1 大豆异黄酮的提取

参照Baú[12]与Yoshiara[18]等的方法，取20 g豆乳粉样品溶于200 mL正己烷中，于25 ℃连续搅拌1 h进行脱脂处理；取3 g脱脂豆乳粉样品用60 mL提取液（蒸馏水、丙酮和乙醇的体积比为1∶1∶1）25 ℃搅拌1 h，将混合物进行超声波浴（25 ℃，15 min），然后进行离心（794×g，4 ℃，15 min），过滤（0.20 μm微孔滤膜）取上清液，得大豆异黄酮提取液。

1.3.5.2 紫外分光光度法测定苷元类异黄酮含量

参照包萨日娜等[9]的方法，标准品分别取异黄酮的苷元形式（黄豆苷元、染料木素和大豆黄素），由标准曲线方程分别得到这3 种形式的异黄酮含量，苷元类异黄酮含量为黄豆苷元、染料木素和大豆黄素含量的总和。

1.3.6 超高效液相色谱法测定豆乳粉中大豆异黄酮的种类及含量

1.3.6.1 标准储备液配制

分别称取1 mg的大豆苷、染料木苷、黄豆黄素苷、丙二酰基大豆苷、丙二酰基染料木苷、丙二酰基黄豆黄素苷、乙酰基大豆苷、乙酰基染料木苷、乙酰基黄豆黄素苷、大豆黄素、染料木素、黄豆苷元，均用60%甲醇溶液配成质量浓度为1 mg/mL的标准储备液。

1.3.6.2 色谱条件

参照Handa等[19]的方法，色谱柱：C18反相液相色谱柱（2.1 mm×50 mm，1.7 μm），进样量：1.4 μL的大豆异黄酮提取液，柱温35 ℃。流动相A：0.2%冰醋酸溶液，流动相B：0.1%醋酸-乙腈溶液。初始洗脱液：90%流动相A，8 min时洗脱液：0% A，9 min内回到初始条件，洗脱速率0.7 mL/min，洗脱时间10 min。各类异黄酮含量的测定通过Empower 2色谱工作站，测定目标峰峰面积之后，带入标准曲线方程计算其含量。

1.4 数据处理

每组都进行3 次平行实验，采用统计学软件SPSS 18对数据进行方差分析、相关性和差异显著性分析；采用Origin 8.5软件进行作图；数据及方差分析利用Design-Expert软件。

2 结果与分析

2.1 萌芽工艺单因素试验结果

2.1.1 萌芽温度对豆乳粉中苷元类异黄酮含量的影响

图1 萌芽温度对豆乳粉中苷元类异黄酮含量的影响Fig. 1 Effects of germination temperature on the contents of isof l avone aglycone in soybean milk powder

由图1可知，当萌芽温度从15 ℃升高到30 ℃时，豆乳粉中苷元类异黄酮含量随萌芽温度的升高有增加趋势，萌芽温度为25 ℃和30 ℃时的苷元型异黄酮含量变化不明显（P＞0.05）。当萌芽温度为35 ℃时，苷元型异黄酮含量显著下降（P＜0.05）。说明25～30 ℃更有利于苷元类异黄酮的积累，原因可能是温度太低，萌发相同长度的大豆芽所需时间相对较长，60 h不能达到苷元类异黄酮的最大转化率，温度过高可能导致苷元类异黄酮向其他形式异黄酮转化，导致苷元类异黄酮减少。综合考虑加热成本与苷元类异黄酮含量变化，选择最佳萌芽温度为25 ℃。

2.1.2 萌芽时间对豆乳粉中苷元类异黄酮含量的影响

由图2可知，当萌芽时间由20 h延长到60 h时，豆乳粉中苷元类异黄酮含量随萌芽时间的延长有显著增加趋势（P＜0.05），萌芽时间为60 h时的苷元类异黄酮含量最高，继续延长萌芽时间，苷元类异黄酮含量显著下降。原因可能是在萌芽初期，随着萌芽时间的延长，通过苯和苯丙途径[20-22]促进总异黄酮的生物合成，且β-葡萄糖苷酶不断催化葡萄糖苷类异黄酮转化为苷元类异黄酮，导致苷元类异黄酮含量不断增加，过度延长萌芽时间，苷元类异黄酮可能转化为其他形式异黄酮，导致苷元类异黄酮含量减少[17,23]。另外由Huang[24]及Paucar-Menacho[25]等的研究可知，在未萌芽大豆中异黄酮形式主要为β-葡萄糖苷类和丙二酰基葡萄糖苷类，经发芽后这两种形式异黄酮含量显著降低，染料木素（苷元型）含量增加，原因可能是在萌芽过程中，丙二酰基类异黄酮也发生了转化，转变为葡萄糖苷类，进而由β-葡萄糖苷酶转化为苷元类异黄酮，进一步证明上述推论[26]。考虑到苷元类异黄酮含量随萌芽时间的变化情况，选择最佳萌芽时间为60 h。

图2 萌芽时间对豆乳粉中苷元类异黄酮含量的影响Fig. 2 Effect of germination time on content of isof l avone aglycone in soybean milk powder

2.2 低温打浆工艺单因素试验结果

2.2.1 浆液pH值对豆乳粉中苷元类异黄酮含量的影响

图3 浆液pH值对豆乳粉中苷元类异黄酮含量的影响Fig. 3 Effect of soymilk pH value on content of isof l avone aglycone in soybean milk powder

由图3可知，当浆液pH值由5.0升高到6.0时，豆乳粉中苷元类异黄酮含量随浆液pH值的升高显著增加（P＜0.05），浆液pH 6.0时，苷元类异黄酮含量最高，继续升高pH值，苷元类异黄酮含量逐渐下降。这与Gricieleaparecida[27]及Matsuura[28]等的研究结果一致，即β-葡萄糖苷酶在研磨过程中与糖苷类异黄酮之间的酶促反应较强，且在pH 6.0时，β-葡萄糖苷酶活性较高，导致糖苷类异黄酮向苷元类异黄酮转化率最大[29-30]。pH值低于或高于6.0时，β-葡萄糖苷酶活性减弱，影响糖苷类异黄酮的转化效率，导致苷元类异黄酮含量下降。考虑到苷元类异黄酮含量随浆液pH值的变化情况，选择最佳浆液pH值为6.0。

2.2.2 打浆温度对豆乳粉中苷元类异黄酮含量的影响

图4 打浆温度对豆乳粉中苷元类异黄酮含量的影响Fig. 4 Effect of pulping temperature on the content of isof l avone aglycone in soybean milk powder

由图4可知，将打浆温度由45 ℃升高到55 ℃时，豆乳粉中苷元类异黄酮含量随打浆温度的升高显著增加（P＜0.05），55 ℃时，苷元类异黄酮含量最高，继续升高打浆温度，苷元类异黄酮含量显著下降（P＜0.05）。原因可能是β-葡萄糖苷酶的活性在55 ℃左右时最高，导致糖苷类异黄酮向苷元类异黄酮转化率最大，低于或高于该温度，β-葡萄糖苷酶活性减弱，影响糖苷类异黄酮的转化效率，导致苷元类异黄酮含量下降。这与Baú等[12]的研究结果一致，其结果表明在温度为64 ℃时，β-葡萄糖苷酶活性降低；但在50 ℃时，β-葡萄糖苷酶活性最高，与本研究结果不一致，原因可能是大豆品质及均质时间不同导致β-葡萄糖苷酶活性的差异。考虑到苷元类异黄酮含量随打浆温度的变化情况，选择最佳打浆温度为55 ℃。

2.2.3 打浆时间对豆乳粉中苷元类异黄酮含量的影响

图5 打浆时间对豆乳粉中苷元类异黄酮含量的影响Fig. 5 Effect of pulping time on the content of isof l avone aglycone in soybean milk powder

由图5可知，随着打浆时间的延长，豆乳粉中苷元类异黄酮含量显著增加（P＜0.05），打浆3 h时，苷元类异黄酮含量最高，继续延长打浆时间，苷元类异黄酮含量有下降趋势。原因可能是随着打浆时间的延长，丙二酰基葡糖苷类异黄酮逐渐转化为β-葡萄糖苷类异黄酮，进而通过β-葡萄糖苷酶的酶促反应转化为苷元类异黄酮，增加豆乳粉中苷元类异黄酮含量[12]。而过度延长打浆时间，部分苷元类异黄酮可能转化为其他形式，β-葡萄糖苷类异黄酮含量可能减少，β-葡萄糖苷酶的酶促反应不再进行，导致苷元类异黄酮含量有下降趋势。且打浆时间过长，会导致豆浆中纤维素颗粒减小，过滤后豆乳中纤维素含量增多，影响豆乳粉口感。综合考虑豆乳粉口感及苷元类异黄酮含量随打浆时间的变化情况，选择最佳打浆时间为3 h。

2.3 萌芽-低温打浆提高豆乳粉苷元类异黄酮含量的响应面试验结果

本试验利用统计软件Design-Expert进行响应面法过程优化，以萌芽温度、萌芽时间、浆液pH值、打浆温度、打浆时间5 个因素为自变量，以苷元类异黄酮含量为响应值，根据中心组合设计原理，具体试验方案与结果如表2所示。

表2 响应面分析试验设计及结果Table 2 Experimental design with results for response surface analysis

续表2

豆乳粉中苷元类异黄酮含量R通过Design-Expert软件对数据进行分析，得到二次回归模型方程：R=6.03+0.45A+0.83B+0.42C+0.42D+0.76E+0.46AB+0.45AC-0.095AD-0.32AE+0.60BC+0.33BD+0.35BE+0.10CD-0.10CE+0.045DE-1.13A2-1.61B2-1.01C2-0.76D2-0.79E2。该二次回归模型的回归与方差分析结果如表3所示。

表3 回归模型方差分析结果Table 3 Analysis of variance for regression model

由表2、3可知，拟合方程线性关系显著，模型回归项为显著（P＜0.000 1），失拟项为不显著（P＞0.05），模型拟合度R2为96.59%，为93.86%，表明该模型可有效模拟试验数据，故可利用该模型对响应值最优值进行理论推测。通过F检验比较得知，各因素贡献率依次为B＞E＞A＞D＞C，即萌芽时间＞打浆时间＞萌芽温度＞打浆温度＞浆液pH值。基于响应面寻优分析确定的最优工艺参数为萌芽温度26.47 ℃、萌芽时间74.56 h、浆液pH 6.12、打浆温度57.43 ℃、打浆时间3.78 h，响应值苷元类异黄酮含量有最优值，为6.54 mg/g。

图6 两因素交互作用对豆乳粉中苷元类异黄酮含量影响的响应面图Fig. 6 Response surface analysis showing the interactive effect of various factorson the content of isof l avone aglycone in soybean milk powder

两因素交互作用影响显著的响应面图见图6。为适应生产，将制备条件优化为萌芽温度25 ℃、萌芽时间75 h、浆液pH 6.0、打浆温度57 ℃、打浆时间3.5 h，此条件下豆乳粉中苷元类异黄酮含量为6.43 mg/g，说明响应值的实验值与回归方程预测值吻合良好。

2.4 不同工艺下豆乳粉中异黄酮种类与含量的对比分析

对比传统湿法工艺（原料为未萌芽大豆）及萌芽-低温打浆工艺（最佳优化参数）制备豆乳粉的异黄酮种类及含量，其结果如表4所示。

表4 不同工艺下豆乳粉中异黄酮的种类与含量Table 4 Types and contents of isof l avones in soybean milk powders produced by different processes

由表4可知，经传统湿法加工制备的豆乳粉主要含有糖苷类异黄酮，经萌芽-低温打浆制备的豆乳粉主要含有苷元类异黄酮；这两种加工工艺制备的豆乳粉均不含有乙酰基类异黄酮，可能是豆乳粉中乙酰基类异黄酮含量极少，低于高效液相色谱法最低检测含量。与传统湿法工艺制备的豆乳粉相比，经萌芽-低温打浆最佳工艺制备的豆乳粉中异黄酮总含量及苷元型异黄酮含量显著增加（P＜0.05），分别增加了1.09 倍及9.37 倍；糖苷类异黄酮总含量及丙二酰基类异黄酮总含量显著减少（P＜0.05），分别减少为原来的44.72%及83.72%，进一步证明萌芽-低温打浆处理提高苷元型异黄酮含量的原因主要是总异黄酮含量的增加及β-葡萄糖苷酶催化糖苷型异黄酮的转化，且丙二酰基类异黄酮含量减少，表明丙二酰基类异黄酮在萌芽-低温打浆处理过程中部分转化为糖苷类异黄酮，进而转化为苷元类异黄酮。传统湿法加工制备的豆乳粉中苷元类异黄酮种类主要为黄豆苷元和黄豆黄素，而萌芽-低温打浆工艺制备的豆乳粉中苷元类异黄酮种类主要为染料木素和黄豆黄素，原因可能是β-葡萄糖苷酶催化糖苷型异黄酮主要转化为染料木素和黄豆黄素。

3 结 论

对萌芽-低温打浆制备高苷元类异黄酮豆乳粉的工艺进行研究，单因素试验表明萌芽温度、萌芽时间、浆液pH值、打浆温度及打浆时间对豆乳粉中苷元类异黄酮含量均有显著影响，由响应面分析结果可知，萌芽-低温打浆最优工艺参数为萌芽温度25 ℃、萌芽时间75 h、浆液pH 6.0、打浆温度57 ℃、打浆时间3.5 h，此条件下豆乳粉中苷元类异黄酮含量为6.43 mg/g。由高效液相色谱分析结果可知，萌芽-低温打浆可显著提高豆乳粉中总异黄酮含量及苷元类异黄酮含量（P＜0.05），与传统湿法工艺相比，其异黄酮总含量增加了1.09 倍，苷元类异黄酮含量增加了9.37 倍。