薯蓣粥对2型糖尿病模型小鼠肠道菌群的影响

谢勇 林中景 葛莉 庞书勤 蔡静雯

流行病学资料显示，2型糖尿病患病人数正在全世界范围内呈逐步上升趋势，病人总数高达1亿以上，而中国已成为世界第一糖尿病大国。现代研究认为，2型糖尿病属于常见的慢性综合性疾病，治疗药物往往难以避免地会对人体造成一些副作用。如控制不当，2型糖尿病可能发展并常伴有肝肾功能损害、白内障等眼病、心脑血管疾病等并发症。由于2型糖尿病患者糖脂代谢紊乱，体内自由基生成增加、清除能力受损，并发症的发生与体内抗氧化能力与自由基之间的失衡密切相关，因此，寻求一种既能降低血糖、血脂又兼有抗氧化作用的膳食疗法，对2型糖尿病并发症的预防显得十分重要。

薯蓣粥是药膳中的经典食疗方，出自清代张锡纯的《医学衷中参西录》，“治阴虚劳热，或喘，或嗽，或大便滑泻，小便不利，一切羸弱虚损之证。”薯蓣粥的食材是生怀山药，山药具有滋阴清热、益气健脾、益胃补肾的功效，对糖尿病患者能够发挥标本兼治、益气养阴、调节脏腑气血阴阳的作用，从而预防糖尿病性中风的发生。现代医学研究表明，怀山药多糖具有明显的降血糖作用。另有研究发现，怀山药在一定程度上还能降低血清脂质和总胆固醇的水平，预防血管的脂肪沉积，保持血管的弹性，防止动脉粥样硬化过早发生，保护糖尿病患者的微血管。

人体肠道拥有超过1000种微生物，肠道菌群也有“新器官”的称谓，其结构或分布的改变直接影响人体健康。研究表明，2型糖尿病患者肠道菌群的表现有一定差异，患者体内厚壁菌门（Firmicutes）与拟杆菌门（Bacteroidetes）两者比值相对升高。这充分说明肠道菌群和糖尿病有着紧密的联系，可以考虑通过控制菌群数量的变化来改善人体健康状况。例如，调控拟杆菌、双歧杆菌、柔嫩梭菌和乳杆菌的变化，或将成为调理糖尿病的新医学靶点；透过肠道菌群与糖尿病的关系，更清晰地研究微生物的结构和功能及其影响人体慢性疾病的机理。

本研究通过建立动物模型，从薯蓣粥调控肠道菌群的角度出发，旨在探究薯蓣粥对2型糖尿病小鼠肠道微生物多样性的影响，为薯蓣粥调控2型糖尿病的作用提供新的研究视角与思路。

一、实验材料

1.薯蓣粥。将新鲜怀山药按经典方《医学衷中参西录》制成薯蓣粥，经真空冷冻干燥后得到薯蓣粉末，按照不同剂量设置加入不同克数的薯蓣粉末并溶于一定量的水，搅拌溶解后放至冰箱冷藏保存。

2.实验试剂。盐酸二甲双胍片，北京京丰制药集团有限公司；链脲佐菌素（STZ），上海麦克林；柠檬酸钠（食品级）和无水柠檬酸（食品级），潍坊英轩实业有限公司。

3.高脂饲料。高脂饲料（D12492）由广东省医学实验动物中心加工提供，配方组成包括酪蛋白、玉米淀粉、蔗糖、麦芽糖糊精、纤维素、豆油、氯化钠、维生素、氨基酸和矿物质等。饲料成分：胆固醇为300.8mg/kg，碳水化合物质量比为26.3%，脂肪质量比为34.9%。

4.实验动物。昆明（KM）种小鼠70只，雄性，体重范围18-22g，清洁级，购自福建省福州市吴氏动物中心；动物饲养温度为20-25℃；实验过程中对动物的处理符合动物伦理学的标准。

二、实验方法

1.制备受试样品溶液。（1）配制薯蓣粥受试样品溶液。本实验薯蓣粥受试样品溶液设置为低、中、高3个剂量组。低剂量组准确称取4.5g薯蓣粉末溶于50mL蒸馏水，设置给药浓度为1.125g/kg；中剂量组准确称取9g薯蓣粉末溶于50mL蒸馏水，设置给药浓度为2.25g/kg；高剂量组准确称取13.5g薯蓣粉末溶于50mL蒸馏水，设置给药浓度为3.375g/kg。将样品溶液搅拌均匀后倒入血清瓶中，放入冰箱冷藏留待使用，使用前加热摇匀，各剂量组每日灌胃量均为0.5mL。（2）阳性对照样品的配制。精确称取0.5g盐酸二甲双胍片，研磨捣碎加入烧杯中，加入100mL蒸馏水搅拌至溶解完全，即可获得浓度为0.06g/kg的陽性样品。盖上保鲜膜常温保存，使用前搅拌均匀。（3）链脲佐菌素（STZ）溶液的配制。取0.58g柠檬酸溶于30mL蒸馏水中配置成A液，取0.88g柠檬酸钠溶于30mL蒸馏水中配置成B液，将A、B两种溶液混合，通过蓝色石蕊试纸测量溶液pH值，调节pH值在4.4左右，即为所需链脲佐菌素缓冲溶液。称量0.255gSTZ，用23mL链脲佐菌素缓冲溶液溶解，即制成138.6mg/kg的链脲佐菌素溶液，要求在30分钟内注射完毕，避免失活。

2.糖尿病模型鼠建立及分组给药。从70只雄性小鼠中随机选取10只小鼠记作空白组，自由饮食饮水，采用正常基础饲料。剩下60只用小鼠用高脂饲料连续饲养4周之后，禁食不禁水约12h，通过腹腔注射的方式注射一定浓度的STZ溶液，诱导建立2型糖尿病模型。3天后，观察小鼠毛发色泽、精神状态、饮食和尿量，进行尾尖剪尾取血，采用罗氏血糖仪进行测量，如随机血糖平均值大于11mmolL-1时，则认定为造模成功。随机分配造模成功小鼠，设置空白组、模型组、二甲双胍组和薯蓣粥组（低、中、高剂量），每组10只，分盒分开进行饲养。空白组和模型组小鼠每日灌胃0.5mL蒸馏水，二甲双胍组小鼠每日灌胃0.5mL盐酸二甲双胍溶液，薯蓣粥各组每日灌胃0.5mL配置好的不同剂量的薯蓣粥溶液，约4周后测量空腹血糖水平并收集粪便样品。

3.观测指标及检测方法。（1）小鼠血糖水平的测定。在实验结束取材前的两周，测量小鼠空腹血糖及体重，小鼠12h禁食不禁水，剪去尾尖血管取血，通过罗氏活力血糖仪进行测量和记录。（2）小鼠粪便肠道菌群检测。实验结束后收取小鼠新鲜粪便，置于无菌离心管并在-80°C低温保存。提取微生物组总DNA序列，采用Nanodrop对DNA进行定量，通过1.2%琼脂糖凝胶电泳检测DNA提取质量。以能够反映菌群组成和多样性的目标序列为靶点，根据序列中的保守区域设计相应引物，基于16SrRNA对V3V4可变区进行检测并采取PCR扩增，PCR时所用引物序列如下：

三、實验结果

1.薯蓣粥对T2DM小鼠血糖的影响。实验结束后将各组小鼠的空腹血糖值进行比较。与空白组相比较，模型组小鼠的空腹血糖显著升高（P<0.05）；与模型组相比较，盐酸二甲双胍组小鼠空腹血糖显著降低（P<0.05），薯蓣粥低剂量组（P<0.01）及薯蓣粥中剂量组（P<0.05）小鼠空腹血糖显著降低。（详见图1）

2.微生物群落结构分析。将数据在细菌菌门、菌纲、菌属水平下进行汇总，并计算这三个分类水平下的细菌丰度。

（1）菌门水平分析（样品Phylum分类水平中物种分析）。从图2可以看出，所有样品80%以上的肠道菌群都为厚壁菌门Firmicutes和拟杆菌门Bacteroidets；其余被检测到的主要菌门还有变形菌门Proteobacteria、放线菌门Actinobacteria等，共约占3.9%-19.7%。与空白组相比较，模型组的厚壁菌门Firmicutes/拟杆菌门Bacteroidetes比值相对升高，拟杆菌门Bacteroidets相对丰度降低，厚壁菌门Firmicutes、变形菌门Proteobacteria和放线菌门Actinobacteria丰度增加。与模型组相比较，二甲双胍组以及薯蓣粥低、中、高剂量组的厚壁菌门Firmicutes/拟杆菌门Bacteroidetes比值下降，厚壁菌门Firmicute相对丰度均减少，变形菌门Proteobacteria和放线菌门Actinobacteria丰度均增加。

A.空白组；B.模型组；C.阳性对照组；D.低剂量组；E.中剂量组；F.高剂量组

（2）菌纲水平分析（样品Class分类水平中物种分析）。从图3可以看出，所有样品50%以上肠道菌群都为拟杆菌纲Bacteroidia和梭菌纲Clostridia；其余被检测到的主要菌纲还有芽孢杆菌纲Bacilli、γ-变形菌纲Gammaproteobacteria等，共约占11.2%-45.6%。与空白组相比较，模型组的拟杆菌纲Bacteroidia和芽孢杆菌纲Bacilli相对丰度减少，梭菌纲Clostridia丰度增加。与模型组相比，二甲双胍组及薯蓣粥各剂量组的γ-变形菌纲Gammaproteobacteria和梭菌纲Clostridia相对丰度减少。

A.空白组；B.模型组；C.阳性对照组；D.低剂量组；E.中剂量组组；F.高剂量组

（3）菌属水平分析（样品Genus分类水平中物种分析）。从图4可以看出，样品中多数以拟杆菌属Bacteroides、乳杆菌属Lactobacillus 、普雷沃菌属Prevotella和颤螺菌属Oscillospira为主，其余还有支原体属Allobaculum、嗜冷杆菌属Psychrobacter等。与空白组相比，模型组的拟杆菌属Bacteroides、乳杆菌属Lactobacillus、普雷沃菌属Prevotella、颤螺菌属Oscillospira和瘤胃球菌属Ruminococcus丰度增加。与模型组相比，二甲双胍组及薯蓣粥各剂量组的颤螺菌属Oscillospira、普雷沃菌属Prevotella和瘤胃球菌属Ruminococcus相对丰度降低，薯蓣粥低、高剂量组的乳杆菌属Lactobacillus丰度均增加。

A.空白组；B.模型组；C.阳性对照组；D.低剂量组；E.中剂量组组；F.高剂量组

四、讨论

山药的主要化学成分包括多糖、氨基酸、脂肪酸、淀粉等，具有降血糖、降血脂、调节脾胃等药理作用。本研究从肠道菌群调节角度，进一步阐述山药的降糖功效及菌群机制。

肠道菌群是携带人体“第二基因”的“隐形器官”，菌群改变可引起胰岛素抵抗、炎症、血管疾病和代谢紊乱，从而介导代谢性疾病的发生发展。胰岛素抵抗的发生起源于肠道菌群紊乱，因此明晰菌群的分布、组成及其特点，或可为2型糖尿病的饮食干预提供新的思考角度。研究表明，柔嫩梭菌属、乳酸菌属、双歧杆菌属和血糖代谢有紧密联系。其中，柔嫩梭菌属具有调节代谢、抵抗炎症的功能；双歧杆菌属和乳酸杆菌属是人体肠道内重要的有益菌，为维持肠道微生态的动态平衡做出贡献。

2型糖尿病患者的厚壁菌门与拟杆菌门的比值上升等一系列实验结果揭示了机体与肠道菌群的关系，在健康和疾病中的重要作用被不断发掘。本实验通过对2型糖尿病模型血糖和肠道菌群实验指标的检测，系统分析上述指标是否具有显著差异。通过肠道菌群多样性分析得出，薯蓣粥低剂量组的菌群丰度及多样性相比模型组均有所增加。小鼠粪便样本中主要的菌群为厚壁菌门（Firmicutes）和拟杆菌门（Bacteroidets），两者之和占80%以上。

与空白组比较，模型组的空腹血糖值明显高于空白组。从菌门角度上看，模型组的厚壁菌门Firmicutes/拟杆菌门Bacteroidetes比值相对升高，拟杆菌门Bacteroidets明显下降，厚壁菌门Firmicutes、变形菌门Proteobacteria和放线菌门Actinobacteria丰度增加；从菌纲角度上看，模型组的拟杆菌纲Bacteroidia和芽孢杆菌纲Bacilli数量减少，梭菌纲Clostridia丰度增加；从菌属上看，模型组的拟杆菌属Bacteroides、乳杆菌属Lactobacillus、普雷沃菌属（Prevotella）、颤螺菌属Oscillospira和瘤胃球菌属Ruminococcus丰度增加。

薯蓣粥各剂量组从菌门角度上看，厚壁菌门Firmicutes/拟杆菌门Bacteroidetes比值相对下降，厚壁菌门Firmicutes相对丰度下降，变形菌门Proteobacteria、拟杆菌纲Bacteroidets和放线菌门Actinobacteria丰度均增加；从菌纲角度上看，γ-变形菌纲Gammaproteobacteria和梭菌纲Clostridia数量均减少；从菌属角度上看，颤螺菌属Oscillospira、普雷沃菌属（Prevotella）和瘤胃球菌属Ruminococcus数量均降低。由此可见，薯蓣粥低、中剂量组具有类似二甲双胍降低空腹血糖值的作用，通过调节肠道菌群多样性及丰度，可以缓解2型糖尿病小鼠的病况。

综上所述，本文从菌群调节角度为薯蓣粥改善模型糖尿病小鼠提供了更深层次的机制探讨，后续实验将进一步研究其对临床2型糖尿病患者肠道菌群的调节作用及机制，为深入开发薯蓣粥这一中国经典药膳提供充足的基础研究材料。（基金项目：福建中医药大学校管课题，课题编号：“X2019049-学科”）

作者简介：谢勇（1976-），博士，教授，研究方向：功能性食品研究。