齐墩果酸氮杂环衍生物合成及对非小细胞肺癌A549作用研究

吴翔宇，罗丽梅，丁 锐，郭牡丹，郑一敏

（1.重庆理工大学 药学与生物工程学院，重庆 400054；2.重庆化工职业学院，重庆 401220）

非小细胞肺癌（non-small-cell lung cancer，NSCLC）属于肺癌的一种，其病例数占肺癌总病例数的85%以上［1］。常年来，非小细胞肺癌有着高病发率与致死率［2-5］，且药物的疗效都不尽如人意，患者迫切需要更为安全有效的治疗药物提高生存率。

齐墩果酸（oleanolic acid，OA）为一种五环三萜类化合物［6］，它存在于青叶胆、女贞子、批把叶等传 统 中 药 中，具 有 抗 病 毒［7-8］、抗 炎［9］、保肝［10］、降糖［11-12］、降血脂［13］、抗骨质疏松［14］等作用。夏荣木等［15］介绍了OA抗肿瘤作用，但活性欠佳。孟艳秋等［16］以齐墩果酸为原料，对C-3位羟基、C-12位双键、C-28位羧基进行结构修饰，合成出一系列新型齐墩果酸衍生物，对A549表现出极强的活性，高于阳性药物吉非替尼，但细胞毒性大。

为提高齐墩果酸抗肺癌有效性和安全性，本研究对合成的齐墩果酸氮杂环新衍生物及其抗非小细胞肺癌A549的作用进行了研究，现报道如下。

1 实验部分

1.1 仪器

85-2型恒温磁力搅拌器（上海司乐仪器有限公司）；DZF-6050型真空干燥箱（上海博迅实业有限公司医疗设备厂）；JA1003N电子天平（上海精密科学仪器有限公司）；SHB-III循环水式真空泵（巩义市予华仪器有限公司）；核磁（NMR）-600 MHz（瑞士Bruker）；Finnigan-LCQDECA（ESI-MS）（美国热电公司）；3111型恒温CO2细胞培养箱（美国赛默飞公司）；Infinite 200 PRO酶标仪（美国赛默飞公司）；XDS-4B型倒置生物显微镜（上海精密仪器仪表有限公司）；SW-CJ-1F节净工作台（苏净安泰空气技术有限公司）；800离心机（常州国华电器有限公司）；FACSVantage SE流式细胞分析仪（上海碧迪医疗器械有限公司）。

1.2 材料

（3，5，6-三甲基吡嗪-2-基）甲醇购于上海毕得医药科技有限公司；齐墩果酸，氯铬酸吡啶嗡盐（PCC），氰基硼氢化钠（NaBH3CN），N’N-羰基二咪唑（CDI），4-二甲氨基吡啶（DMAP）皆购于Adamas公司；乙酸铵（H3CCOONH4），乙酸乙酯（分析纯）（EA），石油醚（分析纯）（PE），甲醇（分析纯）（MeOH），四氢呋喃（分析纯）（THF），二氯甲烷（分析纯）（DCM），高锰酸钾（KMnO4，），无水硫酸钠（Na2SO4），碘皆购于成都市科龙化工试剂厂；RPMI-1640培养基、DMEM（高糖）培养基，胰酶，胎牛血清均购于美国Hyclone公司；CCK-8试剂盒、Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒、Bradford蛋白浓度测定试剂盒、Caspase-3活性检测试剂盒购于碧云天。

1.3 方法

1.3.1 齐墩果酸氮杂环衍生物的合成

以齐墩果酸（1）为原料，通过氧化、还原胺化、缩合反应制备齐墩果酸氮杂环新衍生物（图1）。

图1 齐墩果酸氮杂环衍生物的合成路线示意图

1）3-氧代-12-烯-28-齐墩果酸（2）的合成

氩气保护下，在250 mL三颈瓶中将1（13.701 g，30 mmol）溶于100 mL无水THF，接着以3 mL／min的速度滴加60 mL PCC（12.934 g，60 mmol）的无水THF溶液，室温搅拌反应24 h，薄层色谱（TLC）监控［V（DCM）∶V（EA）＝50∶1为展开剂］。减压旋除THF，得到黑色固体，并以20 mL EA溶解后进行抽滤，再用80 mL EA冲洗硅胶。收集滤液，以水（120 mL×3）萃取，合并有机相，以无水硫酸钠干燥后减压浓缩，浓缩液通过硅胶层析柱（V（DCM）∶V（EA）＝70∶1为洗脱剂）分离纯化。得到10.634 g白色固体粉末2，-18℃密封保存。收率：78.0%。

2）3-氨基-12-烯-28-齐墩果酸（3）的合成

氩气保护下，在100 mL双颈瓶中将2（0.908 g，2 mmol）溶于40 mL无水MeOH，加热至50℃搅拌溶解后，停止加热，冷至室温。加入乙酸铵（1.542 g，20 mmol），室温搅拌60～120 min，接着以3 mL／min的速度滴加20 mL氰基硼氢化钠（0.129 g，2 mmol）的无水MeOH溶液，室温搅拌24 h，TLC监控［V（DCM）∶V（MeOH）＝20∶1为展开剂］。减压浓缩反应液，加入稀NaOH水溶液，调pH值至8，以DCM（50 mL×3）萃取，合并有机相，无水硫酸钠干燥后减压浓缩，浓缩液通过硅胶层析柱［V（DCM）∶V（MeOH）＝40∶1为洗脱剂］分离纯化。得到0.648 g黄色固体粉末3，-18℃密封保存。收率：71.2%。

3）（3，5，6-三甲基吡嗪-2-基）甲酸（5）的合成

在250 mL的三颈瓶中将4（3.000 g，20 mmol）溶于60 mL水，再以3 mL／min的速度滴加60 mL高锰酸钾（4.822 g，30 mmol）水溶液，室温搅拌24 h，TLC监控［V（DCM）∶V（MeOH）＝20∶1为展开剂］。反应液以稀盐酸（6 mol／L）调pH至2，再以EA（100 mL×3）萃取，合并有机相，无水硫酸钠干燥后减压浓缩，浓缩液通过硅胶层析柱（V（DCM）∶V（MeOH）＝30∶1为洗脱剂）分离纯化。得到2.872 g淡红色固体粉末5，-18℃密封保存。收率：87.7%。

4）齐墩果酸氮杂环衍生物（6）的合成

氩气保护下，在50 mL双颈瓶中将5（0.340 g，2 mmol）溶于25 mL无水DCM，加入CDI（0.332 g，2 mmol），室温搅拌60 min。再依次加入3（0.463 g，1 mmol）和DMAP（0.244 g，2 mmol），室温搅拌24 h，TLC监控（V（DCM）∶V（MeOH）＝50∶1为展开剂）。反应液以水（50 mL×3）萃取，合并有机相，无水硫酸钠干燥后减压浓缩，浓缩液通过硅胶层析柱［V（DCM）∶V（MeOH）＝80∶1为洗脱剂］分离纯化。得到0.437 g白色固体粉末6，-18℃密封保存。收率：71.3%；

1H NMR（600 MHz，CDCl3）δ8.03（d，J＝10.1 Hz，1H），5.31（s，1H），3.81（td，J＝10.3，5.6 Hz，1H），2.93（s，3H），2.85（dd，J＝13.6，3.6 Hz，1H），2.55（d，J＝22.3 Hz，6H），2.01（dd，J＝13.4，10.2 Hz，1H），1.96～1.87（m，2H），1.84～1.71（m，2H），1.72～1.56（m，8H），1.52（t，J＝12.7 Hz，1H），1.39（ddd，J＝34.5，28.1，12.5 Hz，3H），1.30～1.02（m，8H），1.01～0.90（m，15H），0.80（s，3H）；13CNMR（151 MHz，CDCl3）δ183.60，164.48，153.83，151.36，147.47，143.70，139.24，122.52，56.60，56.06，47.64，46.59，45.93，41.66，41.01，39.28，38.97，37.96，37.04，33.86，33.08，32.62，32.47，30.68，28.68，27.70，25.91，25.42，23.61，23.40，23.00，22.86，21.90，21.56，18.63，17.15，16.61，15.31；ES-MSof［C38H57N3O3］+：theoretical m／z of［M+H］+＝605.44，measured m／z of［M+H］+＝604.90；ES-MSof［C38H57N3O3］-：theoretical m／z of［M+H］-＝603.44，measured m／z of［M+H］-＝602.84。确证该齐墩果酸氮杂环衍生物为3-N-（3，5，6-三甲基吡嗪-2-甲酰基）-齐墩果酸，命名为QDGS-6。

党的十八大以来，中国铁路昆明局集团主动适应经济发展新常态，深入推进铁路运输供给侧结构性改革，发挥云南省首家5A级综合型物流企业优势，累计完成货物发送2.92亿吨，其中出省物资外运1.4亿吨。

1.3.2 CCK-8法评价化合物QDGS-6对A549、16HBE细胞的细胞增殖抑制作用

配成1×105个／mL处于对数生长期的A549细胞悬液，参照文献［17］的方法评价QDGS-6对A549细胞的活性进行评价。QDGS-6作用浓度分别为：6.25、12.5、25、50、100、200μm；齐墩果酸作用浓度分别为25、50、100、175、200、350μm；5-氟尿嘧啶作用浓度分别为25，50、100、200、300、400 μm，每组设3个复孔，实验重复3次。汇总数据，计算其抑制率与IC50。

配成5×104个／mL处于对数生长期的16HBE细胞悬液后，按同样的方法评价QDGS-6对其的毒性。QDGS-6作用浓度分别为：6.25、12.5、25、50、100、200μm；齐墩果酸作用浓度分别为50、100、175、200、300μm；5-氟尿嘧啶作用浓度分别为25、50、100、200、300、400μm，每组设3个复孔，实验重复3次。汇总数据，计算其抑制率与CC50。

1.3.3 Annexin V-FITC／PI双染色法检测细胞凋亡

参照文献［17］的方法检测QDGS-6对A549细胞的诱导凋亡作用。设立：对照组（不含任何药物的RPMI 1640完全培养基），实验药物组（QDGS-6作用浓度分别为：50、100、200μm，对应高中低3种浓度组），阳性药组（5-氟尿嘧啶作用浓度为400μm）。

1.3.4 Caspase-3试剂盒检测A549细胞中Caspase-3活性

参照文献［17］的方法检测QDGS-6对A549细胞中Caspase-3活性影响。设立：对照组（不含任何药物的RPMI 1640完全培养基），实验药物组（QDGS-6作用浓度分别为：50、100、200μm，对应高中低3种浓度组），阳性药组（5-氟尿嘧啶作用浓度为400μm）。

2 结果

2.1 齐墩果酸氮杂环衍生物对A549细胞与16HBE细胞的增殖抑制作用

表1 QDGS-6对A549细胞的增殖抑制率（，n＝3）

表1 QDGS-6对A549细胞的增殖抑制率（，n＝3）

组别／μm抑制率／%24 h 48 h 72 h 6.25 0.08±0.03 1.48±0.53 4.07±1.26 12.5 1.09±0.67 8.52±3.17 12.71±2.43 25 2.10±0.34 15.15±2.96 20.12±4.34 50 13.76±4.61 32.68±4.78 42.82±5.62 100 39.97±7.54 75.12±3.66 92.26±2.91 200 83.17±2.27 97.35±1.43 98.96±1.16

表2 齐墩果酸对A549细胞的增殖抑制率（，n＝3）

表2 齐墩果酸对A549细胞的增殖抑制率（，n＝3）

组别／μm抑制率／%24 h 48 h 72 h 25 5.54±1.41 11.48±3.12 22.46±2.22 50 16.67±1.78 21.63±1.84 27.72±2.89 100 28.32±1.38 38.31±3.07 41.02±5.14 175 40.12±3.52 42.34±3.89 56.82±1.03 200 51.75±3.86 57.29±1.85 77.26±3.96 350 73.28±1.37 92.35±2.63 97.87±1.86

表3 5-氟尿嘧啶对A549细胞的增殖抑制率（，n＝3）

表3 5-氟尿嘧啶对A549细胞的增殖抑制率（，n＝3）

组别／μm抑制率／%24 h 48 h 72 h 25 4.68±1.98 6.59±2.83 20.16±3.77 50 13.37±3.64 17.63±3.62 28.53±2.24 100 21.26±2.61 23.34±1.16 34.77±1.87 200 41.32±2.36 53.79±1.24 60.91±3.74 300 52.38±4.64 71.26±2.59 84.52±2.09 400 59.24±2.02 79.35±3.36 91.32±2.44

不同浓度的QDGS-6、齐墩果酸和5-氟尿嘧啶分别作用于16HBE细胞不同24、48、72 h后的增殖抑制率分别如表4、5、6所示。随着药物浓度的增大以及作用时间的延长，QDGS-6、齐墩果酸和5-氟尿嘧啶的抑制作用都有不同程度地变强。其中QDGS-6作用于16HBE细胞24、48、72 h的CC50分别为146、98、62μm；齐墩果酸作用于16HBE细胞24、48、72 h的CC50分别为107、89、71μm；5-氟尿嘧啶作用于16HBE细胞24、48、72 h的CC50分别为5 505、74、48μm。

表4 QDGS-6对16HBE细胞的增殖抑制率（，n＝3）

表4 QDGS-6对16HBE细胞的增殖抑制率（，n＝3）

组别／μm抑制率／%24 h 48 h 72 h 6.25 6.21±1.14 11.75±3.33 13.77±5.44 12.5 7.82±3.07 17.95±3.46 19.29±2.82 25 19.14±3.83 28.64±6.22 34.77±4.05 50 33.62±2.67 46.83±1.69 68.29±3.87 100 41.96±6.01 49.36±5.19 79.87±2.59 200 76.91±5.96 92.53±2.94 99.83±0.52

表5 齐墩果酸对16HBE细胞的增殖抑制率（，n＝3）

表5 齐墩果酸对16HBE细胞的增殖抑制率（，n＝3）

组别／μm抑制率／%24 h 48 h 72 h 50 23.04±6.21 34.79±4.95 37.84±3.08 100 35.71±7.10 43.38±3.58 55.06±6.47 175 49.50±3.11 56.52±4.21 88.71±3.35 200 97.75±2.04 96.58±1.56 99.78±1.86 350 98.17±2.48 96.49±1.24 99.32±0.73

表6 5-氟尿嘧啶对16HBE细胞的增殖抑制率（，n＝3）

表6 5-氟尿嘧啶对16HBE细胞的增殖抑制率（，n＝3）

组别／μm抑制率／%24 h 48 h 72 h 25 12.96±2.33 31.21±2.13 38.03±2.54 50 15.67±0.34 42.64±1.48 44.78±3.63 100 18.67±3.28 52.37±2.88 67.47±2.42 200 23.09±2.19 69.54±2.73 91.25±1.10 300 27.07±2.56 79.13±3.81 94.69±1.76 400 29.21±1.28 83.3±1.07 95.39±1.35

综上可得到表7，随着药物浓度的增大以及作用时间的延长，QDGS-6对非小细胞肺癌A549的增殖抑制作用也增强，表明QDGS-6对A549存在剂量和时间的依赖性。通过比较QDGS-6、齐墩果酸和5-氟尿嘧啶的IC50，可知QDGS-6具有更强的抗非小细胞肺癌A549的活性。通过比较选择系数（selection index，SI）可知QDGS-6在细胞水平上较齐墩果酸与5-氟尿嘧啶更为安全。

表7 3种化合物对A549、16HBE细胞的增殖抑制影响

2.2.3 QDGS-6对A549细胞的诱导凋亡作用

如图2所示，QDGS-6作用于A549细胞24 h后，随着QDGS-6浓度的增加，A549细胞的凋亡率也增加，呈现剂量依赖性。高浓度组的凋亡率为67.0%（63.5%早期凋亡+3.5%晚期凋亡），中浓度组的凋亡率为25.84%（19.0%早期凋亡+6.84%晚期凋亡），低浓度组的凋亡率为15.78%（9.23%早期凋亡+6.55%晚期凋亡），阳性药组的凋亡率为20.36%（18.9%早期凋亡+1.46%晚期凋亡），对照组凋亡率为12.55%。提示QDGS-6对A549细胞有着显著的促凋亡作用。

图2 不同剂量QDGS-6对A549细胞凋亡的影响图

2.2 QDGS-6对A549细胞中Caspase-3活性的影响

通过以阳性药和不同浓度的QDGS-6处理A549细胞24 h后，再以caspase-3检测试剂盒和Bradford试剂盒测定得到caspase-3的相对酶活力值，考察caspase-3是否参与了A549细胞的凋亡过程。Bradford标准曲线如图3所示，R2＝0.99，说明蛋白浓度范围为0～1.5 mg／mL时，BSA浓度与OD值的线性关系良好，公式为y＝0.540 3x+0.529 8。pNA标准曲线如图4所示，R2＝0.999 3，说明pNA浓度范围为0～200μm时，pNA浓度与OD值的线性关系良好，公式为y＝0.0026x+0.005。

Caspase-3的相对酶活力单位结果如图5所示。随着药物浓度的增加，caspase-3的相对酶活力单位也相应增加。提示QDGS-6可以增强A549细胞中Caspase-3的活性，这可能是QDGS-6诱导A549细胞凋亡的机制之一。

图3 牛血清白蛋白标准曲线

图4 pNA标准曲线

图5 不同剂量QDGS-6对A549细胞Caspase 3活性的影响直方图

3 讨论

以齐墩果酸为先导化合物，通过氧化、鲍奇还原胺化、缩合等反应得到了齐墩果酸衍生物QDGS-6，通过质谱、核磁共振的方法确证了该结构为3-N-（3，5，6-三甲基吡嗪-2-甲酰基）-齐墩果酸，同时通过文献检索、Reaxys和Scifinder等数据库进行结构比对，确定了QDGS-6为齐墩果酸新型衍生物。体外活性评价实验数据表明，QDGS-6活性相对原料药和阳性药有了明显提高，在细胞水平上的安全性更强，提示齐墩果酸类衍生物在可抑制癌细胞增殖的同时，毒性更低。且QDGS-6可诱导A549细胞株凋亡，增强Caspase-3的酶活性可能是其机制。Caspase-3是Caspase级联反应下游中最重要的凋亡执行者，Bcl-2与Bax蛋白既可作为上级调控机制，又可作为Caspase-3的下游直接底物。为了进一步探寻QDGS-6诱导A549细胞凋亡的机制，可检测Bcl-2与Bax蛋白的表达情况。

首次将齐墩果酸与川芎嗪以酰胺键拼合在一起，在体外活性评价实验中发现，齐墩果酸衍生物QDGS-6的抗非小细胞肺癌的活性相对于齐墩果酸提升的幅度不大，同时其溶解性未得到明显改善，提示该类结构口服体内生物利用度可能较低。汤义等［18］通过在齐墩果酸C-3位连接单糖基，使齐墩果酸衍生物的亲水性基团得到了增加，改善了化合物的溶解性与活性，提示齐墩果酸可以通过连接糖苷类化合物，引入如羧基等亲水性基团，从而得到溶解性更好的化合物。