高效液相色谱法测定特殊膳食中的烟酸和烟酰胺

李 越，方亚莉

（山西省食品药品检验所，山西太原 030031）

烟酰胺与烟酸统称为维生素PP，主要存在于动物内脏、肌肉组织中，水果、蛋黄中也有微量存在，在酵母、米糠、麦麸和肉类中含量丰富，是人体必需的13种维生素之一。烟酰胺在体内与核糖、磷酸、腺嘌呤构成辅酶Ⅰ和辅酶Ⅱ，它们是许多脱氢酶的辅酶，在体内生物氧化中起脱氢和加氢作用，与很多代谢过程包括葡萄糖酵解、脂肪代谢、丙酮酸代谢和高能磷酸键的生成等有密切关系。烟酸在体内转化为烟酰胺才能发挥上述作用。此外烟酸还有较强的外周血管扩张作用[1]。人体内烟酸不足时会影响糖的酵解、柠檬酸循环、呼吸链以及脂肪酸的生物合成，从而引起烟酸缺乏症。

目前，烟酸和烟酰胺的检测方法主要有微生物法[2]、高效液相色谱法[3]。微生物法需在无菌条件下操作，成本较高，检验周期长，过程较复杂[4]。本研究结合实验室现有设施条件，参照GB 5009.89—2016[5]中高效液相色谱法，选择特殊医学用途配方食品作为试验材料，建立了HPLC测定特殊膳食中烟酸和烟酰胺的方法。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

某品牌均衡型全营养配方粉；烟酸（来源：中国食品药品检定研究院，含量：99.9%）；烟酰胺（来源：SUPELCO，含量：99.9%）；盐酸；氢氧化钠；甲醇（色谱纯）；异丙醇（色谱纯）；庚烷磺酸钠（优级纯）；高氯酸（体积分数为60%）；实验用水为一级超纯水。

1.2 仪器与设备

岛津LC-2040高效液相色谱仪、超声波提取器、OHAUS AR224CN电子天平、OHAUS DV215CD 电子天平和酸度计。

1.3 试验方法

1.3.1 样品前处理

称取混合均匀固体试样约5.0 g（精确到0.01 g），加入约25 mL 45～50 ℃的水于150 mL锥形瓶中，将上述锥形瓶置于超声波振荡器中振荡约10 min，充分溶解，静置5～10 min， 并冷却至室温。待试样溶液降至室温后，用盐酸（5.0 mol/L和0.1 mol/L）调节试样的pH值至1.7±0.1，放置约2 min后，再用氢氧化钠溶液（5.0 mol/L和0.1 mol/L）调节试样溶液的pH值至4.5±0.1。将试样溶液转至100 mL容量瓶中，用水反复冲洗锥形瓶，洗液合并于100 mL容量瓶中，用水定容至刻度，混匀后经滤纸过滤，滤液再经0.45 μm微孔滤膜加压过滤，用样品瓶收集，即为试样待测液。

1.3.2 标准溶液及工作曲线配制

（1）标准储备溶液。准确称取烟酸及烟酰胺标准品各 0.01 g，分别置于10 mL容量瓶中，用水溶解定容，配制成 1.0 mg/mL的标准储备液。

（2）标准工作系列的制备。分别准确吸取标准储备液 2 mL至50 mL容量瓶中，用水稀释定容，配制为40 μg/mL的混合标准中间液。根据检测需要，将混合标准中间液稀释配制成浓度为0 μg/mL、0.5 μg/mL、1.0 μg/mL、2.0 μg/mL、4.0 μg/mL和8.0 μg/mL的标准系列工作溶液。

1.3.3 液相色谱条件

色谱柱：C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；柱温：25 ℃±0.5 ℃；进样体积：10 μL；流速：1.0 mL/min；紫外检测器：检测波长为261 nm；流动相：甲醇70 mL、异丙醇20 mL、庚烷磺酸钠1 g，用910 mL水溶解并混匀后，用高氯酸调pH至2.1±0.1，经0.45 μm膜过滤。

2 结果与分析

2.1 线性关系及检出限

将配制的标准系列工作溶液在上述仪器条件下进行测定，以峰面积Y为纵坐标、待测组分的浓度X为横坐标，绘制工作曲线，经线性回归后求得相关系数，结果见表1。取0.03 μg/mL的烟酸标准工作液，0.04 μg/mL的烟酰胺标准工作液，在上述仪器条件下进行测定，由图谱得信噪比约为3∶1，故烟酸的检出限为30 μg/100 g，烟酰胺的检出限为40 μg/100 g。定量限为检出限的3倍，烟酸和烟酰胺的定量限分别为0.9 mg/kg、1.2 mg/kg。

表1 目标化合物的线性回归参数及定量限

2.2 方法回收率与重复性

分别称取样品5.0 g，加入适量的混合标准溶液，使得样品中目标化合物的加标浓度如表2中所示。每个浓度进行6次平行试验，按照前述方法处理并上机测定，计算平均回收率及RSD，结果见表2，目标物的回收率为91%～102%，平均回收率为95%～102%，相对标准偏差均＜20%。

表2 烟酸和烟酰胺加标回收率及重复性试验结果

2.3 精密度与稳定性试验

本研究分别考察了7.952 0 μg/mL浓度水平的烟酸和8.519 2 μg/mL浓度水平的烟酰胺，分别在0 h、1 h、2 h、 4 h、6 h和8 h后进样，计算其RSD，烟酸RSD为0.12%，烟酰胺RSD为0.20%。表明方法精密度与稳定性良好。

3 结论

本研究建立的HPLC测定特殊膳食中烟酸和烟酰胺的方法，目标化合物保留时间相对稳定，线性关系、重复性、回收率、精密度和稳定性等考察结果良好，能够满足实验室对特殊膳食中烟酸和烟酰胺准确、快速、高通量的检测需求。