烟酰胺及联合伊曲康唑体外抗烟曲霉活性研究

陈显振 朱信霖 姜伟伟 扈东营 张克明 方文捷 潘炜华 刘晓刚 廖万清

(1.海军军医大学第二附属医院皮肤科，上海 200003; 2.上海市医学真菌分子生物学重点实验室，上海 200003)

【关键字】 烟曲霉；烟酰胺；伊曲康唑；联合治疗

近年来，随着器官移植、免疫抑制剂的应用、放化疗等医疗手段的不断发展，侵袭性曲霉病发病率逐年上升[1]。烟曲霉是侵袭性曲霉病的主要病原体，占比约90%，其次为黄曲霉和黑曲霉。目前治疗该疾病的药物较为局限，主要有唑类、多烯类和棘白菌素类药物。肝肾毒性、电解质紊乱等不良反应限制了两性霉素B的应用[2]，而棘白菌素类药物因价格昂贵、缺乏口服剂型，临床应用受限[3]。自1997年首次报道烟曲霉伊曲康唑耐药株以来，全世界多个国家陆续报道烟曲霉对唑类耐药现象，且呈上升趋势[4]。因此，临床亟需发掘新的抗真菌药物及抗真菌药物增敏剂。

烟酰胺为维生素B3体内衍生物，可用于糙皮病、神经退行性疾病和皮肤癌等临床疾病的治疗与预防[5-7]，同时，烟酰胺还可用于农作物真菌病害的防治，如啶酰菌胺(烟酰胺类内吸收性杀菌剂)通过抑制菌丝及孢子生长，从而对农作物真菌性侵害发挥良好的防治效果[8]。既往研究表明烟酰胺对多种微生物具有抑制作用[9-14]，同时烟酰胺还可以增强青蒿素、氯喹、乙胺的抗疟作用[11]以及氟康唑的抗真菌活性[13]。然而烟酰胺对烟曲霉的抗真菌能力尚不明确，与伊曲康唑联用是否具有增效能力也未确定。本研究通过体外药敏实验对烟酰胺的抗烟曲霉活性及联合对伊曲康唑的增效活性进行探索，为临床抗真菌用药提供新思路。

1 材料和方法

1.1 菌株

15株烟曲霉，均来自上海市医学真菌分子生物学重点实验室菌种库。

1.2 抗真菌药物

伊曲康唑(ITR)、烟酰胺(NAE)，均购于Sigma。ITR用二甲基亚砜(DMSO)溶解并配成6 400 μg/mL的储存液，NAE用生理盐水配成200 mg/mL的储存液。

1.3 抗真菌药敏试验

伊曲康唑及烟酰胺单独作用于烟曲霉的药敏试验 根据CLSI M38-A2方案[15]进行烟曲霉的体外抗真菌药物敏感性测定(工作浓度梯度分别为：ITR 0.12～16 μg/mL，NAE 0.8～102.4 mg/mL)；质控菌株为克柔念珠菌ATCC 6258。48 h后观察结果，与阳性对照孔相比≥50%生长抑制所对应的药物浓度为质控菌株的MIC，100%抑制烟曲霉生长所对应的浓度为烟曲霉的MIC值。

伊曲康唑联合烟酰胺的抗烟曲霉活性参照CLSI M38-A2方案并稍作修改进行菌株药物敏感性测定，将药物储存液用RPMI-1640稀释为4倍最大工作浓度(工作浓度梯度分别为：ITR 0.00375～0.5 μg/mL，NAE 0.2～25.6 mg/mL)，倍比稀释为所需浓度梯度。按照如下方法进行操作：使用排枪分别取50 μL倍比稀释的伊曲康唑工作液，自高浓度至低浓度依次加至96孔板的第1～8列；自高浓度到低浓度的顺序，取50 μL倍比稀释后的烟酰胺工作液依次加入96孔板的第1～8行；向已加药液孔分别加入100 μL菌悬液；第11列为阴性对照(只加200 μL RPMI-1640)，第12列为生长对照(100 μL菌悬液加100 μL RPMI-1640)。37℃恒温培养48 h，用放大镜观测仪判定结果。

联合用药效能评价标准：分级抑制指数(FICI)=MIC(A药联合)/MIC(A药单用)+MIC(B药联合)/MIC(B药单用)。当FICI≤0.5时，两药为协同作用；当0.54时，两药为拮抗作用。

1.4 RT-qPCR检测烟曲霉膜蛋白及外排泵相关基因表达水平

以烟曲霉标准株Af293为研究对象，向SDB培养基中加入孢子，使最终菌密度为(1～5)×105CFU/mL，220 r/min，35℃恒温培养箱中培养16 h后，分别加入烟酰胺与伊曲康唑使每管药物浓度达到亚致死浓度(烟酰胺12.8 mg/mL，伊曲康唑0.12 μg/mL)，培养8 h后收集菌丝[17]。参照丝状菌RNA抽提和逆转录试剂盒(TIANGEN)操作得到cDNA，对膜蛋白基因cyp51A、erg3、erg24、erg25及外排泵基因cdr1B基因表达进行PCR扩增，内参为GAPDH,反应过程：95℃，3 min；95℃ 5s、60℃ 10s、72℃ 15s，40个循环。采用2-ΔΔCT法进行数据分析，相关引物见表1。

表1 引物序列

2 结 果

2.1 伊曲康唑及烟酰胺单独作用于烟曲霉的药敏试验

体外药物敏感性试验表明，烟酰胺对烟曲霉具有抑菌作用，MIC为12.8～25.6 mg/mL。15株烟曲霉中有2株(CZZJ100527、CZZJ100528)伊曲康唑的MIC>2 μg/mL，对伊曲康唑耐药株，其余MIC为0.25～1 μg/mL ，为伊曲康唑敏感株(见表2)。

2.2 伊曲康唑联合烟酰胺的抗烟曲霉活性

烟酰胺联合伊曲康唑对15株烟曲霉的MIC值见表2。烟酰胺的MIC值由12.8～25.6 mg/mL降至0.2～6.4 mg/mL，伊曲康唑的MIC值由0.25～16 μg/mL降至0.00375～0.12 μg/mL。烟酰胺联合伊曲康唑的FICI值均小于0.5，表明烟酰胺联合伊曲康唑具有协同作用。

表2 烟酰胺单用及联合伊曲康唑作用于烟曲霉的MIC值

2.3 RT-qPCR检测烟曲霉膜蛋白及外排泵相关基因表达水平

通过对膜蛋白及外排泵相关基因进行相对表达分析，结果显示，与对照组相比，烟酰胺加药组膜蛋白基因cyp51A、erg3、erg24、erg25及外排泵基因cdr1B的表达水平显著下调；与伊曲康唑加药组相比，联合加药组cyp51A、erg3、erg24、erg25、cdr1B的mRNA表达水平显著降低。说明NAE作用于Af293可下调膜蛋白基因cyp51A、erg3、erg24、erg25及外排泵基因cdr1B的表达水平，而且NAE对ITR降低Af293膜蛋白基因cyp51A、erg3、erg24、erg25及外排泵基因cdr1B的mRNA水平有增效作用(见图1)。

图1 AF293加药组与不加药组膜蛋白及外排泵蛋白的基因相对表达量

3 讨 论

近年来，随着免疫抑制人群数量的不断增加，侵袭性曲霉病的发病率也不断升高，全世界年发病率约为25万例[18]，烟曲霉是侵袭性曲霉病最常见的病原体[19]。很多研究报道烟酰胺具有保护神经、抗炎、抗糖尿病、保护皮肤及缓解肾功能不全等功能[20]，近些年发现烟酰胺对一些微生物如结核分枝杆菌、HIV、念珠菌、隐球菌等具有抑制作用[9,13,21]，然而烟酰胺对烟曲霉的抑制情况尚无相关报道，本研究发现，NAE对烟曲霉具有抑制作用，MIC为12.8～25.6 mg/mL，与烟酰胺对念珠菌的抑菌浓度相近[13]。伊曲康唑为临床曲霉病的常用药，然而自1997年Denning[22]课题组首次报道检出对伊曲康唑耐药的烟曲霉后，全球范围内有关烟曲霉对伊曲康唑耐药的报道日渐增多。有研究发现通过药物联用方式，不仅可以增效还可以逆转耐药株，如汉防己甲素与伊曲康唑联合使用时，汉防己甲素可增加伊曲康唑抑制烟曲霉的作用同时可逆转伊曲康唑耐药株[23]，烟酰胺联合氟康唑也具有协同抑制白念珠菌及逆转氟康唑耐药株的作用[13]。因此本研究对烟曲霉进行烟酰胺联合伊曲康唑的药敏实验，结果发现烟酰胺可增强伊曲康唑抑制烟曲霉的作用，且对伊曲康唑耐药烟曲霉菌株具有逆转耐药的作用，为伊曲康唑增敏剂研究提供了新的思路。

烟曲霉对唑类药物耐药机制主要有唑类药物靶蛋白(Cyp51A)过表达及外排泵蛋白的过表达等[24]。因此可通过抑制麦角甾醇的生物合成及抑制外排泵基因的表达来增强唑类药效[25]。Cyp51A为14-α-羊角甾醇去甲基酶，唑类与该酶结合抑制该酶活性，影响麦角甾醇合成及细胞膜结构和功能，Erg3、Erg24、Erg25均为麦角甾醇合成过程中的催化酶[26]。Cdr1B属于三磷酸腺苷结合盒(ATP-binding cassette)转运蛋白超家族，英国Paul Bowyer课题组发现该蛋白的高表达可以增加烟曲霉对伊曲康唑的耐药性[27]。我们对部分麦角甾醇合成通路蛋白的基因cyp51A、erg3、erg24、erg25及外排泵基因cdr1B进行了加药与不加药的RT-qPCR检测，结果发现单用烟酰胺时，这些基因的表达较对照组下调，联合用药时，这些基因较伊曲康唑组下调，由此推测，烟酰胺可能通过抑制膜蛋白及外排泵相关基因的表达来发挥抑菌作用，从而联合伊曲康唑发挥抗烟曲霉的增效作用，但具体的信号通路和作用机制有待进一步研究。综上，本研究为烟曲霉感染患者的临床用药提供新的思路。