非洲猪瘟疫苗研究进展

时云朵，孙 豪，曹恬雪，郑灿财

（1.四川省水产学校，成都 611730；2.雅安市农业农村局，四川 雅安 625000；3.资阳市雁江区农业农村局，四川 资阳 641399；4.四川省农业规划建设服务中心，成都 610041）

非洲猪瘟（African swine fever，ASF）是由非洲猪瘟病毒（African swine fever virus，ASFV）引起的一种猪的传染病，于1921 年首次在肯尼亚被发现[1]，因其临床症状与传统猪瘟高度相似，且发现于非洲而被命名为非洲猪瘟。目前，全球ASF疫情复杂严峻，多国发生ASF 疫情，自2018 年8 月以来，我国先后发生多起ASF疫情，严重威胁生猪产业发展。为全力做好疫情防控，世界多国开展了ASF疫苗研究，我国也紧急开展了疫苗、免疫机制等科技攻关，对ASFV的基因组和免疫机制等方面的研究取得了较大进展，为ASF的疫苗研究奠定基础。本文概述了ASF疫苗研制面临的挑战和研究进展，为ASF疫苗开发提供参考。

1 非洲猪瘟疫苗研制面临的挑战

1.1 非洲猪瘟病毒的形态与结构

ASFV呈20面体对称，直径为175～215 nm，由外囊膜、衣壳、内囊膜、核壳和类核组成。外囊膜的形态与细胞质膜的“单位膜”特征相似，通过宿主细胞膜获得外囊膜[2]。衣壳有17 280 个蛋白质，1 个主衣壳蛋白p72 与4 个次衣壳蛋白（M1249L、p17、p49 和H240R）构成5 个不对称子和3 个对称子结构；次衣壳蛋白形成一个复杂的网络，通过将邻近的衣壳体连接在一起来稳定衣壳，形成衣壳的骨架[3]。内囊膜呈单层脂质膜样，源于宿主细胞内质网，含有蛋白p12、p17、p54 和pE248R 等[4]。核壳是一层厚约30 nm的蛋白层，围绕着类核，主要由蛋白pS273R 和聚蛋白pp220 及pp62 的加工产物构成；蛋白pp220被加工为蛋白p150、p37、p34和p14 等，pp62 可衍生为蛋白p35 和p15 等，组成核壳的6 种主要成分，占病毒粒子总质量的32%[4]。上述结构细节揭示了ASFV 结构稳定性和组装的基础，为ASF疫苗研发开辟了途径。

1.2 非洲猪瘟病毒具庞大基因组

ASFV 属非洲猪瘟病毒科非洲猪瘟病毒属，是唯一双链闭合线性DNA 虫媒病毒[5]。1995 年首次完成ASFV 的全基因组测序[6]，其基因组的末端是发卡环结构，紧邻末端的是由串联重复序列和多基因家族构成的可变区，中间部分则是比较稳定的基因区[7]。可变区基因拷贝数的变化是造成不同地区ASFV 分离株基因组大小存在差异的主要因素[8]，根据p72基因末端核苷酸的差异分析，现已鉴定出24种ASFV基因型，其中基因1型、2型和8型毒力最强，我国首次发现的ASFV毒株（SY18株）属于基因2 型[9]。ASFV 的DNA 分子长度为170～193 kb，含150～167 个开放阅读框，编码150～200 种蛋白质[10]，编码蛋白中已知功能的数量相对较少，制约了ASFV的疫苗研究。

1.3 非洲猪瘟病毒的免疫逃逸机制

ASFV 能在自然宿主软蜱和野猪体内复制，弱毒株能引起猪的持续性感染，而绝大部分灭活疫苗无保护作用，即使添加新型免疫佐剂也不能提高灭活疫苗的保护力，提示ASFV具有逃避宿主防御系统的有效机制。ASFV 基因组不具有感染性，主要在巨噬细胞的胞浆内进行复制，是一个高度受调控的过程[11]。ASFV 编码许多调节宿主细胞对病毒感染应答的蛋白，其主要策略是调节感染巨噬细胞的信号传导途径，从而干扰大量免疫调节基因的表达。如在ASFV 感染早期表达的A238L能够抑制宿主细胞NF-κB和NFAT信号通路[10]，从而调节宿主基因表达；而在感染晚期表达的凋亡抑制蛋白pA224L 能够激活NF-κB 信号通路，通过抑制细胞凋亡，促进ASFV 感染细胞的存活，最终利于病毒自身的繁殖与扩散。同时，ASFV感染过程中表达的pDP71L能促进翻译起始因子eIF2a磷酸化，使宿主细胞持续合成蛋白质，抑制自噬体的形成，并抑制细胞凋亡，从而促进病毒在细胞内的大量复制[10]。目前，对ASFV的研究仍存在较大空白，特别是免疫逃逸机制。持续深入研究ASFV编码蛋白鉴定和蛋白功能，有助于了解ASFV编码蛋白与宿主细胞间的相互作用机制，为研发ASF疫苗提供理论基础。

2 非洲猪瘟疫苗类型

2.1 灭活疫苗

灭活疫苗是采用物理或化学方式消除病原微生物的致病性，保留免疫原性而获得的疫苗。因制作灭活疫苗的技术成熟，最早被用在ASF疫苗的研制上，但不能提供有效的保护性。即使S.Blome 等[12]将当时最先进的免疫佐剂（Polygen、Emulsigen-D）加入ASFV灭活制剂后免疫仔猪，虽免疫猪均产生了特异抗体，但未观察到免疫保护作用，还轻微加速了临床过程。但开发新型的免疫佐剂，仍是制作有效ASFV疫苗的新尝试。

2.2 弱毒疫苗

弱毒疫苗是预防ASF 的潜力最大的疫苗。目前，主要有天然弱毒株疫苗、传代培养弱毒株疫苗、基因缺失弱毒株疫苗。与灭活疫苗相比，弱毒疫苗能够诱导强烈持久的细胞、体液免疫应答，同源保护率高，对免疫动物能提供较高水平的保护，但存在毒力返强的可能，临床副作用严重，生物安全隐患较大。

2.2.1 天然弱毒株疫苗

目前，ASFV 的天然弱毒株有ASFV/NH/P68、OUR/T88/3、Lvl7/WB/Riel。研究表明，ASFV/NH/P68 能促进T 淋巴细胞与NK 细胞的活性，免疫接种后的猪能抵御ASFV/L60 毒株的攻击[13]，但部分接种猪出现肺炎、流产等多重感染[14]。经OUR/T88/3 免疫接种后的猪能抵御OUR/T88/1、Benin 97/1和genotype X Uganda毒株的攻击。随着CD8+T淋巴细胞的消耗，免疫效果减退[15-16]，表明该疫苗的保护性存在CD8+T 淋巴细胞依赖性，且有异源保护的可能，但免疫的猪会出现发热、关节肿胀等临床症状。Lvl7/WB/Riel 减毒株经口服免疫野猪后能抵御Arm07 强毒株的攻击，保护率达到92%，但该疫苗生产困难，且可产生高热、肺炎、运动障碍等副作用。因此，生物安全风险限制了天然弱毒株作为防控疫苗的实际使用价值与可行性。

2.2.2 传代培养弱毒株疫苗

ASFV可在猪源细胞系如Vero与CV1细胞内不断传代培养，降低其毒力。A.D.Sereda等[17]将经猪骨髓细胞传代培养后的弱毒株接种猪，结果表明，弱毒株对同源强毒株的攻击可以提供有效的保护。A.Lacasta 等[18]将经CV1 传代致弱的E75CV1毒株免疫接种猪后，产生了与亲本不同的免疫途径，能抵御同源毒株的攻击，但不能抵御异源毒株。西班牙、葡萄牙曾利用传代致弱毒株免疫猪却产生灾难性后果。近年来，随着分子生物学技术的进步，尤其是基因编辑技术的突破性进展，基于自然毒株弱化的方式已逐渐被淘汰，因此传代培养弱毒株是未来有望推向市场的候选疫苗，俄罗斯研制的传代细胞适应株（Arriah CV-1 株）已被欧盟作为重点研究的候选株[19]。

2.2.3 基因缺失弱毒株疫苗

利用基因编辑、同源重组等现代分子生物学技术敲除ASFV的毒力相关基因，获得基因缺失毒株，用于疫苗研制。目前，研究主要集中在敲除免疫逃逸基因或与病毒复制有关的基因。M.V.Borca等[20]敲除ASFV-G10分离株的8D基因，获得ASFVG-Δ8DR基因缺失株，通过肌肉注射和滴鼻接种的方式接种猪后，表现出与ASFV-G 相同的毒力，且病毒血症值也没有差异，表明8DR基因的缺失与ASFV-G 分离株的毒力明显下降无关。而P. L. Monteagudo 等[21]敲除ASFV-BA71 分离株的EP402R 基因，获得BA71ΔCD2 基因缺失株，免疫接种后，诱导特异性CD8 T 细胞识别同源株BA71、异源株E75 及ASFV-G，产生交叉保护作用。此外，V. O'Donnell 等[22]敲除ASFV-G07 株的9GL基因，获得ASFV-G-Δ9GL基因缺失株，肌肉注射接种后，可以抵御同源毒株的攻击，继续敲掉UK基因，获得ASFV-G-Δ9GL/ΔUK双基因缺失株，接种后，对于同源毒株的攻击提供100%的保护，且安全性比ASFV-G-Δ9GL更高。表明，在ASFV 基因缺失弱毒株疫苗研究时，为减弱毒力，提高保护性，要采取不同毒株敲除不同的基因或同一毒株同时敲除几个基因的方式。因此，中国农业科学院哈尔滨兽医研究所的Chen W.等[23]同时敲除ASFV 的7 个基因，构建ASFV 基因缺失弱毒株HLJ/18-7GD，免疫接种SPF 猪、商品猪和怀孕母猪，能抵御强毒株的攻击，且未见返强，表明该基因缺失株具有较好的保护性和安全性，有望用于ASF防控中，但交叉保护性有待进一步验证。

2.3 基因工程疫苗

2.3.1 亚单位疫苗

亚单位疫苗是利用特异性基因和蛋白的表达来产生特异性免疫应答的一类疫苗，具有安全性高、特异性强的特点。ASF亚单位疫苗主要是利用真核或原核细胞作为表达载体，表达具有中和表位的保护性抗原基因（如结构蛋白基因p12、p30、p54、p72、pp62 和膜蛋白基因CD2v 等），产生的蛋白质或多肽诱导机体产生中和抗体，然而已研发的亚单位疫苗尚不能有效抵御强毒株的攻击。G.P.Paulino等[24]认为ASFV的p72、p54及p30蛋白疫苗能够抑制病毒的依附及内化过程，从而影响病毒复制，在病毒攻击易感细胞后中和病毒，但免疫接种后的猪不能抵御强毒株的攻击。J.G.Neilan等[25]利用杆状病毒表达ASFV 的p30、p54、p72 及p22蛋白，免疫接种猪后均可有效诱导产生中和抗体，能延迟猪发病，但不能提供有效的免疫保护。J.K.Jancovich 等[26]用痘病毒表达ASFV的47个蛋白，免疫接种后，致死剂量的强毒株攻击后，猪的血液和淋巴组织中病毒基因组水平显著降低，表明单一抗原引起的机体免疫应答不足以提供全面的保护。M. V. Murgia 等[27]利用甲型病毒载体表达ASFV 的p30、p54 和p72 蛋白先行免疫接种启动免疫原性，然后用减毒活病毒疫苗加强免疫的策略，能扩大对ASFV 表位的识别。齐艳丽等[28]利用大肠杆菌载体，结合细胞融合技术，获得ASFV 的p54蛋白单克隆抗体，其最低效价为1∶2 500，与猪伪狂犬病等病毒不发生交叉反应，能识别p54 蛋白C端127-146aa 肽段。这表明鉴定更多的ASFV 保护性抗原，是提高亚单位疫苗免疫效力的思路。

2.3.2 DNA疫苗

ASF 的DNA 疫苗与亚单位疫苗相似，前者是将ASFV的抗原基因克隆入真核表达载体后，直接导入机体内，在宿主细胞内完成转录翻译后产生抗原蛋白，从而激活猪特异性的体液免疫和细胞免疫。但其免疫原性与亚单位疫苗相似。J.M.Argilaguet等[29-30]和A.Lacasta等[31]研究发现，用ASFV的基因（P54、P30）构建的重组质粒DNA疫苗（pCMVPQ），接种小鼠后能诱导免疫反应，而免疫猪却不能诱导免疫反应；为提高猪的免疫应答，将ASFV基因（P54、P30、sHA）与猪白细胞抗原Ⅱ特异性抗体或血凝素构建新的重组质粒DNA 疫苗（pCMVAPCH1PQ、pCMV-sHAPQ），可成倍增强猪的免疫应答，但不能抵御强毒株的攻击；为增强诱导细胞毒性T淋巴细胞（CTL）的效应，将ASFV 基因（P54、P30、sHA）及泛素融合构建重组质粒DNA 疫苗（pCMV-UbsHAPQ），在缺乏抗体的情况下诱导特异性T细胞应答，且部分免疫猪抵御了ASFV的致命攻击，表明T细胞免疫与预防ASF密切相关；为证明存在具有保护潜能的CD8 T细胞决定因子，构建了包含4 000多个单个质粒克隆的表达库，每个克隆随机包含ASFV基因组的Sau3AI限制性片段（p54、p30和血凝素）融合到泛素，用该表达库免疫猪，对E75 强毒株致死攻击的保护率为60%，表明ASFV基因组中存在额外的保护性决定因素。

2.3.3 病毒活载体疫苗

细胞免疫在ASF防控中扮演重要角色，而CTL的效应更是免疫效果的保证，因此，可利用病毒活载体在机体内持续复制与表达的特性研制病毒活载体疫苗。目前，常用腺病毒、伪狂犬病病毒、牛痘病毒或新城疫病毒作为载体构建疫苗，可有效刺激细胞免疫和CTL 效应。S. Lokhandwala等[32-33]研制的腺病毒载体的非洲猪瘟病毒抗原具有免疫原性，能引起猪强烈的免疫反应，但不能抵御强毒株的攻击[34-35]。表明病毒活载体疫苗免疫保护效力需要进一步评价。

3 小 结

ASF在国内已得到有效控制，但其危害性不可忽视，研发安全有效的ASFV疫苗仍是当下亟须解决的问题。目前，在ASFV 基因序列、功能结构、入侵方式及宿主对其免疫应答等方面的研究取得了较大进展，并尝试了多类别的疫苗研发，虽获得了一定的效果，但仍没改变尚无有效疫苗可用的现状，应持续深入加强病毒与宿主相互作用的基础性研究。弱毒活疫苗能持续诱导机体产生中和抗体，成为可提供高效、安全的保护性疫苗的首选，但毒力返强问题是其致命弱点，因此采用现代生物学技术，敲除毒力基因，获得减毒基因缺失株是研制疫苗值得关注的研究方向。同时，更高效的免疫佐剂探索、更多的抗原位点识别研究及多种疫苗的相互联用，也是今后值得关注的方向。此外，高效安全的特异性疫苗虽是防治ASF的最佳手段，但在疫苗研制举步维艰的情况下，可采用针对病毒转录复制过程来抑制病毒增殖，如RNA 干扰技术、有机试剂阻断技术等，同时要持续加强生物安全风险控制，切断病毒传播途径，同样也能达到防控ASF的目的。