野燕麦对精唑禾草灵的敏感性水平及其ACCase基因序列分析

王祥宇, 郝巧巧, 远鑫洋, 刘润强, 王洪亮, 张 佩,2

(1.河南科技学院资源与环境学院/河南省生物药肥研发与协同应用工程研究中心,河南新乡 453003;2.河南省博士后创新实践基地,河南新乡 453003)

1 材料与方法

1.1 试验材料

表1 2018—2021年所采集野燕麦种子信息Table 1 Population information of A. fatua collected in 2018-2021

1.1.2 主要仪器 PCR仪[耶拿分析仪器(北京)有限公司]、电泳仪(北京君意东方电泳设备有限公司)、电子天平(上海众渊实业有限公司)、电热恒温水浴锅(上海跃进医疗器械有限公司)、涡旋振荡仪[艾卡(广州)仪器设备有限公司]、GTR16-2型高速冷冻离心机(北京时代北利离心机有限公司)、ASS-4 型自动控制农药喷洒系统(北京盛恒天宝科技有限公司)。

1.2 试验方法

1.2.1 供试种子信息 2018—2021年所采集的野燕麦种子信息见表1。

待野燕麦植株生长到1～2叶期时定苗,留20株/盆,继续培养至2～3叶期,采用北京盛恒天宝科技有限公司生产的 ASS-4 型自动定量喷雾系统(扇形喷头型号为TEEJET-9503EVS,喷雾塔为ASS-4型)进行茎叶喷雾处理。设定喷雾压力为 0.275 MPa,喷液量为 450 L/hm2,喷液速度为 1.2 L/min,喷头与植株之间的距离50 cm。根据预试验确定各种群处理剂量,本试验采用6个处理,分别为3.9、15.5、31.0、62.0、124.0、248.0 g a.i./hm2,每个处理4盆。另设清水作为空白对照(CK),在处理21 d后测定地上部茎叶的鲜重,计算每个野燕麦种群的鲜重抑制率,同时将药剂处理后存活的单株叶片留存,每个处理重复4次共28盆,整体重复2次。

1.2.3 野燕麦的ACCase基因克隆及序列分析 待野燕麦生长到3～4叶期,剪取100 mg叶片,放入研钵中加入液氮研磨,提取方法根据DNA Quick Plant System[非离心柱型,天根生化科技(北京)有限公司]说明书进行。根据NCBI上已公布的与野燕麦同源性较高的大穗看麦娘(Alopecurusmyosuroides)的ACCase 基因序列(登录号:AJ310767)设计1对引物[8]:正向引物,3′-CTGAATGAAGAAGACTATGGTCG-5′;反向引物3′-TCCTCTGACCTGAACTTGATCTC-5′。

PCR扩增目的基因长度为1 050 bp,退火温度为55 ℃,包括1 781～2 088氨基酸突变位点。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司负责合成。反应体系为25 μL,参数为:94 ℃ 2 min;94 ℃ 30 s,55 ℃ 30 s,72 ℃ 1.5 min,35个循环;72 ℃ 10 min,电泳验证结果,完成后将PCR产物送至生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序。将测序所得序列在 NCBI 上进行 BLAST 比对,用BioEdit软件对扩增出的抗性与敏感野燕麦种群的ACCase基因序列进行比对,分析是否发生特定位点氨基酸突变。每个种群检测10株植株。

1.2.4 数据处理及抗性分级 使用R软件“drc”程序包中drm函数的W 1.4非线性拟合方程统计分析,导入原始数据计算出抑制中剂量(ED50)值[10]。根据每个野燕麦种群的ED50值,计算不同野燕麦种群的相对抗性倍数[11]。ED50值的计算公式:

(1)

式中:x表示鲜重抑制率;e表示ED50值;c和d分别代表置信区间的下限和上限;b代表e附近的相关斜率。

相对抗性倍数(RI)=抗性种群的ED50值/敏感种群ED50值。

(2)

参考 Beckie等的方法[12],将相对抗性倍数分为 4 个等级:RI<2 表示敏感或不抗种群(S),2≤RI<5 表示低水平抗性种群(L),5≤RI≤10 表示中水平抗性种群(M),RI>10表示高水平抗性种群(H)。

2 结果与分析

2.1 不同野燕麦种群对精唑禾草灵的敏感性

表2 不同野燕麦种群对精唑禾草灵的敏感性Table 2 Susceptibility of different populations of A. fatua to fenoxaprop-P-ethyl.

2.2 抗精唑禾草灵野燕麦种群ACCase基因序列分析

表3 不同野燕麦种群ACCase基因突变位点比对Table 3 Comparison of ACCase gene mutation sites in different populations of A. fatua

3 讨论与结论

杂草对除草剂产生抗性已成为麦田作物草害治理的重大难题之一,为了有效控制杂草的危害、延缓抗药性的发展,对野燕麦的防除采用综合防治的策略,同时做到科学用药,并选用不同作用机制的除草剂交替使用[29]。