不同疫苗接种对鸡免疫学功能的影响试验

欧小英，欧阳敏

（1.宁远县动物卫生监督所，湖南 宁远 425600；2.宁远县桐山街道农业综合服务中心，湖南 宁远 425600）

近年，我国养禽业发展迅速，品种多、数量大、养殖模式多样化[1]，集约化、现代化、生态化健康养殖模式是未来发展趋势。我国是世界上第一养禽大国，但还不是养禽强国[2]。禽病是影响养禽业健康发展最主要的因素，不仅影响禽类的存活率和生长发育速度，而且还影响家禽的产蛋率和种禽质量[3]。

禽病防控面临的形势依然严峻，做好禽病综合防控工作至关重要，其中疫苗接种是最有效的手段之一[4-5]。新城疫和禽流感是目前对养禽业危害比较严重的两种疫病[6-7]，为了探讨这两种疫病免疫预防时的相互影响，本试验将市售的鸡新城疫-传染性支气管炎-禽流感（H9亚型）三联灭活疫苗与其他禽类疫苗同时接种鸡，于接种后不同时间进行血清抗体监测，并与单独接种其他禽类疫苗鸡的血清抗体进行对比，了解不同疫苗对鸡免疫学功能的影响，现将试验结果报道如下。

1 材 料

1.1 试验疫苗

两批鸡新城疫-传染性支气管炎-禽流感（H9亚型）三联灭活疫苗（La Sota 株+M41 株+YBF003 株），以下简称“新支流三联”（批号为180010900 和180020900），市售，哈尔滨某公司产品。

1.2 注射器

1 mL 注射器，购自上海治宇医疗器械有限公司。

1.3 试验蛋鸡

14日龄健康海兰褐蛋鸡，市售。

1.4 疫苗、抗原及血清

重组禽流感病毒H5 亚型二价灭活疫苗（细胞源，Re-6株+Re-8株），批号为20180401，市售。

禽流感病毒H5 亚型血凝抑制试验抗原与阳性血清，均购自哈尔滨维科生物技术开发有限公司。

2 方 法

2.1 试验分组

取14 日龄海兰褐蛋鸡40 只，分成4 组，每组10 只。第1 组：颈部皮下注射新支流三联（批号为180010900）疫苗，注射剂量为0.3 mL·只-1，同时肌肉注射禽流感H5 亚型二价灭活疫苗（细胞源，Re-6 株+Re-8 株），注射剂量为0.3 mL·只-1；第2组：颈部皮下注射新支流三联（批号为180020900）疫苗，注射剂量为0.3 mL·只-1，同时肌肉注射禽流感H5 亚型二价灭活疫苗（细胞源，Re-6 株+Re-8株），注射剂量为0.3 mL·只-1；第3 组：肌肉注射重组禽流感病毒H5 亚型二价灭活疫苗（细胞源，Re-6 株+Re-8 株），注射剂量为0.3 mL·只-1；第4组（对照组）：不接种任何疫苗。试验鸡于疫苗注射后14、21、28天逐只采血，分离血清，进行H5亚型Re-6株禽流感HI抗体效价测定，并通过比较各组HI 效价的几何平均值，来分析对鸡免疫学功能是否存在影响。试验分组情况见表1。

表1 试验分组

2.2 检测方法

2.2.1 临床观察

注射疫苗前及注射后28 d，每天系统观察试验鸡的精神状态、行为活动、粪便状况、采食和饮水情况。

2.2.2 HI抗体效价测定

2.2.2.1 血凝抗原工作液配制

血凝抗原凝集价测定：取禽流感病毒H9 亚型血凝抑制试验抗原在96 孔V 型微量反应板进行血凝试验，每孔加25 μL PBS（0.1 mol·L-1，pH7.0～7.2），第1 排加25 μL 血凝抗原，并进行2～4 个重复孔，然后进行2倍系列稀释，稀释后每孔再加入25 μL PBS，最后再加入1%鸡红细胞悬液25 μL，在微量振荡器上混匀，室温静置20～40 min，当对照孔中的红细胞呈显著纽扣状时判定结果。以使红细胞100%凝集的最高稀释倍数作为判定终点。各成分量及加样顺序详见表1。

血凝抗原工作液（4 HAU）配制：根据测定的血凝抗原凝集价，按照公式计算配制4 个血凝单位（即4 HAU）工作液稀释倍数，即稀释倍数=血凝抗原凝集价/4。如血凝抗原凝集价为1∶256，则配制4 HAU 血凝抗原工作液时应用PBS 稀释64 倍（256/4=64）。按照计算出的倍数用PBS 配制4 HAU 血凝抗原工作液。

4 HAU血凝抗原工作液检验：将配制好的4 HAU血凝抗原工作液用PBS 稀释，使其稀释度为1∶2、1∶3、1∶4、1∶5、1∶6、1∶7，从每一稀释度中取出25 μL，加入25 μL PBS，再加入1%鸡红细胞悬液25 μL，振荡混匀，室温静置20～40 min 后判定结果。如1∶4 稀释为100%红细胞凝集终点，表明配制的是4 HAU血凝抗原工作液；如100%红细胞凝集终点是1∶5 或1∶6，表明配制的4 HAU 血凝抗原工作液实际上高于4 个单位；如100%红细胞凝集终点是1∶2 或1∶3，表明配制的4 HAU 血凝抗原工作液实际上低于4个单位。应根据检验结果适当调整，使抗原工作液为4 HAU血凝抗原工作液。

2.2.2.2 红细胞凝集抑制（HI）试验

各成分量及加样顺序详见表2。

表2 微量血凝抑制试验（微量法）术式μL

待检血清样品稀释：第1～11 孔加入25 μL PBS，第12孔加入50 μL PBS。在第1孔加入25 μL待检血清样品，充分混匀后吸取25 μL 加至第2 孔，依次2 倍稀释至第10 孔，从第10 孔吸取25 μL弃去。

加入4 HAU 血凝抗原工作液：第1～11 孔均加入25 μL 的4 HAU 血凝抗原工作液，第12 孔不加4 HAU 血凝抗原工作液作为对照，在室温（20～25 ℃）下静置20～40 min进行中和。

加入红细胞：每孔加入25 μL 1%（V/V）的鸡红细胞悬液。

血凝抑制反应：将反应板在振荡器上振荡1～2 min 或轻扣反应板混合反应物，在室温（20～25 ℃）下静置20～40 min，根据血凝图像判定结果。对照红细胞将呈显著纽扣状。（每次测定时应设阴性血清对照和已知HI 抗体效价的阳性血清对照）

结果判定：将微量板倾斜45°。当阴性对照血清HI 效价不高于1∶4（微量法）、阳性对照血清HI效价与已知效价相比误差不超过1个效价值时，试验方法成立。若红细胞沉淀呈泪珠状流淌，判为HI阳性；若红细胞在孔底均匀分布或呈锯齿状凝集，判为HI阴性。以完全抑制4 HAU血凝抗原工作液的最高稀释倍数判为该待检血清样品的HI效价。

3 结果与分析

3.1 临床观察结果

试验鸡临床表现见表3。

表3 不同组别试验鸡临床观察结果

从表3 可以看出，试验观察期内，4 组试验鸡全部健活，精神良好，采食、饮水、行为和粪便等未见异常，无其他全身不良反应。

3.2 HI抗体效价检测

HI抗体检测结果见表4。

表4 各组不同时间点H5亚型禽流感HI抗体效价测定结果

从表4 可以看出，注射后14、21 和28 d 同时接种两种疫苗，第1 组（新支流三联180010900批）鸡血清中H5 亚型禽流感HI 抗体效价分别为1∶68.6、1∶207.9 和1∶415.6，第2 组（新支流三联180020900批）鸡血清中H5亚型禽流感HI抗体效价分别为1∶68.6、1∶207.9 和1∶445.7；第三组单独注射重组禽流感病毒H5 亚型二价灭活疫苗（细胞源，Re-6 株+Re-8 株）组鸡血清中H5 亚型禽流感抗体效价分别为1∶64.0、1∶194.0 和1∶388.0，健康对照组鸡血清中H5亚型禽流感HI抗体效价均不高于1∶24.3。说明接种2种疫苗试验鸡血清H5亚型禽流感HI抗体效价与单独注射重组禽流感病毒H5亚型二价灭活疫苗（细胞源，Re-6 株+Re-8 株）组无明显差异，证明不同疫苗免疫对鸡免疫学功能无影响。

4 讨 论

在家禽养殖过程中会面临各种疾病的挑战，药物治疗存在不对症、不及时、效果差等诸多问题，常常会造成巨大的经济损失。疫苗免疫是目前较为常用且有效的手段，但预防不同的疫病要使用不同的疫苗，不同疫苗的同时接种偶尔会存在相互干扰的情况，如张大俊[8]进行了羊痘疫苗与小反刍兽疫疫苗同时或单独免疫效果比较及分析，结果羊痘疫苗和小反刍兽疫疫苗同时免疫促进了小反刍兽疫疫苗的抗体水平，抑制羊痘的抗体水平，表明羊痘和小反刍兽疫疫苗同时免疫不利于羊痘疫苗在体内产生较好的免疫应答。但也有相当多的研究表明，不同疫苗同时多点接种，免疫效果不受影响，孟丽军等[9]进行了猪口蹄疫、猪瘟、高致病性蓝耳病三种疫苗不同组合同时分点免疫的效果观察，结果表明猪口蹄疫、猪瘟、高致病性蓝耳病3 种疫苗同时分点免疫，免疫副反应率比较低，特别是进行二免、三免后抗体效价更高。华利忠等[10]进行了鸡滑液囊支原体活疫苗（MS-H 株）同时免疫对新支二联活疫苗免疫效力影响的调查，结果表明同时免疫滑液囊支原体活疫苗并未对新支二联活疫苗的免疫效力产生影响。沈亚菊等[11]进行了重组禽流感病毒（H5+H7）三价灭活疫苗和鸡新城疫、禽流感（H9 亚型）、禽腺病毒病（Ⅰ群4 型）三联灭活疫苗联合免疫效果研究，结果表明两种禽流感疫苗混合后联合免疫的安全性和免疫效果与单苗免疫相当，无干扰现象，可减少鸡群应激，节省人工。本试验结果也表明新支流三联与重组禽流感病毒H5 亚型二价灭活疫苗接种对鸡免疫学功能无影响。

5 结 论

不同疫苗免疫对鸡免疫功能的影响试验结果显示，试验鸡同时接种鸡新城疫-传染性支气管炎-禽流感（H9亚型）三联灭活疫苗和重组禽流感病毒H5 亚型二价灭活疫苗（细胞源，Re-6 株+Re-8株）疫苗所产生的抗体效价与单独接种重组禽流感病毒H5亚型二价灭活疫苗（细胞源，Re-6株+Re-8株）的抗体水平相当，两者无明显差异。说明上述两种不同疫苗对鸡免疫学功能未产生影响。