3,4-二羟基苯乙酸对高脂膳食诱导小鼠糖脂代谢紊乱的调节作用

丁桂园,任顺成,朱晓艾

河南工业大学 粮油食品学院,河南 郑州 450001

糖脂代谢紊乱被认为是诱导肥胖、2型糖尿病和心血管等慢性疾病的主要因素。联合国《2019世界粮食安全和营养状况》报告显示,全球每年因肥胖致死400多万人[1]。据国际糖尿病联合会统计,2021年全球糖尿病患者人数达到5.37亿;2045年全球糖尿病患病人数预计将达到7.83亿[2]。糖脂代谢紊乱严重危害人类健康,不仅造成经济负担,而且导致人们生活质量和寿命下降。目前治疗糖脂代谢紊乱的方法主要有口服降糖药或减肥药、注射胰岛素和减肥手术等,但都存在一系列严重的副反应,如头晕、失眠及腹泻等[3-4]。因此,寻找安全、有效的膳食活性成分以预防机体的糖脂代谢紊乱势在必行。近年来,具有减肥和降糖生物活性的多酚类膳食化合物引起了人们的广泛关注。

槲皮素(3,3’,4’,5,7-五羟基黄酮)是一种膳食多酚,广泛存在于蔓越莓、樱桃、洋葱、石刁柏、莴苣等水果和蔬菜中[5]。槲皮素及其糖苷类化合物因良好的安全性和生物活性,已被欧美国家批准作为食品补充剂并广泛应用于功能食品中[6],具有抗肥胖[7-8]、抗糖尿病[9-10]、预防心血管疾病[11]、抗病毒[12]、抗过敏[13]、抗抑郁[14]等作用,其中有小部分(5%～10%)被胃肠道吸收,大部分(90%以上)在结肠微生物的作用下,生成易被吸收且可在体内发挥生物活性的小分子代谢物,如3,4-二羟基苯乙酸、3,4-二羟基苯丙酸、3,4-二羟基苯甲酸等[15-17]。据目前研究报道,这些小分子代谢物中仅有3,4-二羟基苯乙酸具有较高的清除自由基活性、抗炎活性、调节胰岛素功能和防止肝损伤的作用[18-24]。例如,3,4-二羟基苯乙酸显著抑制了过氧化氢诱导的肝细胞毒性,增强了总谷胱甘肽s-转移酶活性[18],发挥抗氧化作用;3,4-二羟基苯乙酸通过防止氧化应激、细胞凋亡和线粒体功能障碍保护Min6胰腺β细胞免受胆固醇诱导的胰岛素分泌受损[19];3,4-二羟基苯乙酸可以减少2型糖尿病小鼠的氧化应激和炎症反应,减轻高血糖和胰岛素抵抗,有助于缓解2型糖尿病症状[20];3,4-二羟基苯乙酸能够增强大鼠离体胰岛中的葡萄糖刺激胰岛素分泌[21];3,4-二羟基苯乙酸在高糖条件下通过改善大鼠NRK-52E细胞中的胰岛素信号和葡萄糖稳态而具有抗糖尿病作用[22-23];此外,3,4-二羟基苯乙酸可减少乙酰氨基酚对小鼠肝脏的毒性和防止肝损伤[24]。因此,3,4-二羟基苯乙酸可能是槲皮素及其糖苷类化合物在机体内调控糖脂代谢紊乱的主要活性物质。

目前关于3,4-二羟基苯乙酸调节糖脂代谢作用的研究主要集中于体外实验,而关于其在体内具有调节糖脂代谢紊乱的生物活性尚未进行充分研究。因此,作者采用高脂膳食诱导C57BL/6 糖脂代谢紊乱小鼠模型,探讨3,4-二羟基苯乙酸对糖脂代谢紊乱的调节作用,对指导治疗糖脂代谢紊乱提供新思路和新方法,为全面评估3,4-二羟基苯乙酸的营养价值和功能特性提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

SPF级雄性C57BL/6小鼠(许可证号：ZZU-LAC2021101216)：北京维通利华实验动物技术有限公司;正常对照饲料(D12450J,能量配比为10%脂肪、70%碳水化合物、20%蛋白质)和高脂饲料(D12492,能量配比为60%脂肪、20%碳水化合物、20%蛋白质)：常州鼠一鼠二生物科技有限公司。动物饲料配方如表1所示。

表1 饲料配方Table 1 Compositions of experimental diets g

3,4-二羟基苯乙酸：上海源叶生物科技有限公司;甘油三酯(TG)试剂盒、总胆固醇(TC)试剂盒、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)试剂盒、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)试剂盒：南京建成生物工程研究所。

1.2 仪器与设备

FA1004电子分析天平：上海上平仪器公司;血糖仪：江苏鱼跃医疗设备股份有限公司;酶标仪、CL10高速冷冻离心机：赛默飞世尔科技(中国)有限公司;冰箱：海尔集团。

1.3 方法

1.3.1 动物实验

45只SPF级雄性5周龄的C57BL/6小鼠,适应性喂养1周后,随机分配为3组(每组15只),分别为：正常对照组(ND组,饲喂正常饲料)、高脂模型组(HFD组,饲喂高脂饲料)、3,4-二羟基苯乙酸组(DOPA组,饲喂高脂饲料+0.05% 3,4-二羟基苯乙酸)。动物饲养于河南省实验动物中心SPF级动物实验室,5只/笼,饲养温度(22±2) ℃,相对湿度(55±10)%,每隔12 h光照/黑暗循环,自由饮食饮水,共喂养10周。每周记录每组小鼠的摄食量、饮水量和体重。第10周末,每组C57BL/6小鼠禁食8 h后,摘眼球采血、颈椎脱臼致死。随后测量小鼠体长,解剖小鼠并取出器官组织(心、肝、脾、肺、肾及肾周脂肪和附睾脂肪),生理盐水漂洗,滤纸吸干,称量,立即放入干冰中冷冻,保存于-80 ℃的冰箱中。本次动物实验经河南省实验动物中心伦理委员会批准后,严格按照动物实验要求开展。

1.3.2 小鼠体重和Lee′s指数的测定

实验期间记录小鼠精神活动、毛色变化、排泄物等生活状况[25]。每周对各组小鼠称重,记录体重。小鼠处死后,记录小鼠鼻尖至肛门的长度为小鼠的体长。根据各组小鼠体长和体重,计算各组小鼠的Lee′s指数(肥胖指数)。

Lee′s指数=小鼠体重1/3×103/小鼠体长。

1.3.3 小鼠脏器指数的测定

根据各组小鼠的脏器质量(心脏、肝脏、脾脏、肺脏和肾脏)与体重,计算各组小鼠的脏器指数。

脏器指数=脏器质量/体重×100%。

1.3.4 小鼠附睾脂肪和肾周脂肪系数的测定

根据各组小鼠的脂肪组织质量(附睾脂肪和肾周脂肪)与体重,计算各组小鼠的脂肪系数。

脂肪系数=附睾脂肪或肾周脂肪质量/体重×100%。

1.3.5 小鼠血清生化参数的测定

第10周实验结束时采集小鼠的眼眶血,4 ℃、3 500 r/min离心15 min,然后保存于-80 ℃冰箱中。血清TG、TC、LDL-C和HDL-C水平按照市售试剂盒的说明书进行测定。

1.3.6 小鼠血糖的测定

第10周进行口服葡萄糖耐量实验(OGTT)：禁食12 h后,所有小鼠接受2 h的OGTT检测。按照葡萄糖剂量为2 g/kg,对小鼠进行灌胃,分别在6个不同的时间点：灌胃前(0 min)和灌胃后15、30、60、90、120 min,使用血糖仪测定血糖浓度,分别记为G0、G15、G30、G60、G90、G120。计算OGTT曲线的线下面积(AUC)。

1.4 数据统计与分析

所有数据均以平均值±标准差表示。采用SPSS 27.0进行单因素方差分析,比较组间的统计学意义。采用Origin 2021绘制图表。

2 结果与分析

2.1 小鼠一般生长情况

整个实验过程中,动物房环境控制良好,干净整洁,温度、湿度均处于正常范围。各组小鼠生活和精神状况良好,正常进食进水,活动自如,对外界刺激反应迅速,无腹泻。各组小鼠粪便的颜色为黑褐色,形状为长颗粒状,尿液正常。ND组和DOPA组小鼠体毛光泽度好。HFD组小鼠出现体毛油腻状,DOPA组小鼠明显改善。除ND组1只小鼠死亡外,其余组小鼠无死亡现象。

2.2 3,4-二羟基苯乙酸对高脂膳食小鼠体重、Lee′s指数、摄食量和饮水量的影响

体重是衡量动物健康和糖脂代谢平衡的直接指标。Lee′s指数作为肥胖指标,其值越大代表肥胖度越大[26]。由图1(a)可知,第1周各组间小鼠体重均无显著性差异。从第2周到第10周,HFD组小鼠的体重较ND组明显升高。第5周时HFD组小鼠的体重超过ND组小鼠20%,即高脂模型小鼠建模成功。与HFD组相比,第1周至第3周,DOPA组小鼠的体重无显著性差异;而从第5周至第10周,3,4-二羟基苯乙酸处理显著降低了高脂膳食诱导小鼠的体重升高。从图1(b)和(c)可知,与ND组相比,HFD组小鼠体重增加和Lee′s指数显著增加,ND组和HFD组小鼠的体重分别增加(3.19±0.62 ) g、(9.50±1.16 ) g;Lee′s指数分别为337.70±7.81、363.89±8.43。饲养10周结束时,与HFD组相比,DOPA组小鼠体重增加(7.54±1.22 ) g、Lee′s指数(357.29±7.19)明显下降。

注：不同小写字母表示差异显著(P<0.05)。图2—图4同。图1 3,4-二羟基苯乙酸对高脂膳食小鼠体重、体重增加、Lee′s指数、摄食量和饮水量的影响Fig.1 Effects of 3,4-dihydroxyphenylacetic acid on body mass,body weight gain,Lee′s index,food intake,and water intake in high-fat diet mice

摄食量和饮水量也是反映小鼠健康状况的重要指标。由图1(d)和(e)可知,ND组、HFD组和DOPA组每只小鼠日均摄食量分别为(2.43±0.14) g、(2.46±0.10) g、(2.43±0.14) g;每只小鼠日均饮水量分别为(3.11±0.25) g、(3.08±0.21) g、(2.93±0.26) g ,但3组小鼠的每只小鼠日均摄食量和日均饮水量均无明显差异。3,4-二羟基苯乙酸能够在不影响摄食量和饮水量的前提下显著降低高脂膳食小鼠体重的增加,减轻了其肥胖特征。

2.3 3,4-二羟基苯乙酸对高脂膳食小鼠脏器指数、附睾脂肪和肾周脂肪系数的影响

脏器指数是药物毒性最敏感的指标之一。由图2(a)可知,3,4-二羟基苯乙酸干预后,高脂膳食小鼠的心脏指数、脾脏指数、肺脏指数和肾脏指数与正常饲料饲养的小鼠相比没有显著差异,说明3,4-二羟基苯乙酸对小鼠的心脏、脾脏、肺和肾脏无毒害作用。高脂膳食对小鼠肝脏的损伤程度可用肝脏指数反映[27]。HFD组小鼠的肝脏指数(3.45%±0.09%)显著高于ND组(3.25%±0.25%),说明高脂膳食诱导小鼠肝脏肿大和损伤;与HFD组相比,DOPA组小鼠的肝脏指数(3.30%±0.25%)显著降低,说明3,4-二羟基苯乙酸能够防止肝脏肿大、改善肝脏损伤和保护肝脏组织。

图2 3,4-二羟基苯乙酸对高脂膳食小鼠脏器指数、附睾脂肪和肾周脂肪系数的影响Fig.2 Effects of 3,4-dihydroxyphenylacetic acid on viscera indexes,perirenal fat and epididymal fat coefficients in high-fat diet mice

脂肪系数可有效判断机体糖脂代谢紊乱水平。由图2(b)可知,与ND组相比,HFD组小鼠的附睾脂肪和肾周脂肪系数显著升高,说明高脂膳食导致小鼠附睾和肾周脂肪的积累。与HFD组相比,DOPA组小鼠的附睾和肾周脂肪系数分别显著降低了55.90%、40.50%,与Ting等[7]的研究结果相符,连续8周185 mg/kg的槲皮素膳食补充显著降低高脂膳食诱导肥胖小鼠的附睾脂肪和肾周脂肪系数。以上结果表明,3,4-二羟基乙酸有效抑制了脂肪在体内的积累,因而控制了体重的增长。

2.4 3,4-二羟基苯乙酸对高脂膳食小鼠血脂的影响

血脂反映脂代谢的情况,主要与体内脂肪含量和机体对脂肪的利用有关,高脂膳食通常会导致血脂升高和异常[28]。血清中TC、TG、HDL-C和LDL-C水平升高是高脂膳食小鼠的主要特征,提示小鼠患有高脂血症[29]。由图3可知,HFD组小鼠血清TC、TG和LDL-C水平分别比ND组显著高了38.30%、16.28%、387.32%,说明高脂膳食可诱导 C57BL/6小鼠血脂代谢紊乱。与HFD组相比,DOPA组小鼠血清TC、TG和LDL-C水平分别显著下降了20.90%、24.75%、45.09%。ND组、HFD组和DOPA组小鼠的HDL-C水平之间均没有显著差异。并且DOPA组的血清TC和TG含量基本达到ND组水平,说明3,4-二羟基苯乙酸显著减少高脂膳食小鼠血脂水平。该结果与Kuipers等[8]的结论相符,0.1%的槲皮素在不影响高脂膳食C57BL/6小鼠食物摄入量的情况下显著降低血清TG。Han等[30]研究结果表明,连续17周的0.04%五甲氧基槲皮素可显著降低高脂膳食C57BL/6小鼠的血清TG水平,但其血清TG浓度高于本研究中0.05% 3,4-二羟基苯乙酸高脂膳食C57BL/6小鼠的血清TG浓度。因此,3,4-二羟基苯乙酸有利于减少脂质在肥胖小鼠血液中的积累,缓解高脂膳食诱导的脂代谢紊乱。

图3 3,4-二羟基苯乙酸对高脂膳食小鼠血清TG、TC、LDL-C和HDL-C的影响Fig.3 Effects of 3,4-dihydroxyphenylacetic acid on serum TG ,TC ,LDL-C,and HDL-C in high-fat diet mice

2.5 3,4-二羟基苯乙酸对高脂膳食小鼠血糖的影响

葡萄糖耐量主要反映人体或动物自身对血糖浓度的调节能力[26]。AUC是反映葡萄糖被机体利用程度的一个重要参数,即AUC可评价葡萄糖的净利用率。在第10周对小鼠进行口服葡萄糖耐量实验,评估3,4-二羟基苯乙酸对高脂膳食小鼠糖耐量的影响。如图4(a)所示,各组小鼠在被灌喂2 g/kg葡萄糖溶液后血糖浓度急剧增加,15 min时ND组和DOPA组小鼠的血糖浓度达到最大值,而30 min时HFD组小鼠的血糖浓度达到最大值,随着时间增加,各组小鼠血糖浓度逐渐降低。其中0～120 min HFD组小鼠血糖浓度均显著高于ND组,同时HFD组的AUC显著升高(图4(b)),说明高脂膳食诱导小鼠机体对血糖浓度调节能力下降,糖代谢紊乱。与HFD组相比,DOPA组小鼠在30 min的血糖浓度显著降低(图4(a)),同时3,4-二羟基苯乙酸可显著降低高脂膳食小鼠的AUC(图4(b))。由图4(a)可知,DOPA组小鼠空腹血糖值显著低于HFD组,并且120 min时DOPA组小鼠血糖值接近ND组。该结论与Peng等[9]的研究相一致,在生长期为12周时,0.1%槲皮素改善了高脂膳食诱导肥胖小鼠的糖耐量和胰岛素抵抗的能力,减轻了脂肪的积累。但与Tan等[31]的研究结果相比,本研究中空腹血糖值和OGTT 120 min血糖值均低于干预12周0.05%芦丁的高脂膳食C57BL/6小鼠。以上结果表明,3,4-二羟基苯乙酸具有显著改善高脂膳食小鼠的糖耐量和调节血糖平衡的能力。

图4 3,4-二羟基苯乙酸对高脂膳食小鼠OGTT和AUC的影响Fig.4 Effects of 3,4-dihydroxyphenylacetic acid on OGTT and AUC in high-fat diet mice

3 结论

通过测定各组小鼠的体重、体内脂肪系数、脏器指数、血脂血糖水平等基础生理生化指标,分析3,4-二羟基苯乙酸对高脂膳食诱导肥胖小鼠糖脂代谢紊乱的调节作用。结果表明,3,4-二羟基苯乙酸可显著减缓高脂膳食小鼠的体重增加和Lee′s指数,减少高脂膳食小鼠肾周脂肪和附睾脂肪的积累,降低高脂膳食小鼠的肝脏指数和血清中TC、TG和LDL-C的水平,改善高脂膳食小鼠血糖水平。3,4-二羟基苯乙酸具有调节高脂膳食诱导小鼠糖脂代谢紊乱的生物活性,但调节机制还需要进一步的实验和临床研究来探索,并寻找其潜在的临床应用。