高效液相色谱法同时测定小麦粉中乙二胺四乙酸二钠、曲酸和间苯二酚

姜志远，马可佳，王 缘，王晓婧，赵 岚

（黑龙江省疾病预防控制中心，黑龙江哈尔滨 150030）

小麦粉中含有丰富的淀粉、蛋白质、脂肪及膳食纤维等营养成分，是北方居民餐桌上重要的主食来源，因此市售小麦粉的品质受到食品监管部门的高度重视。但有些不法商贩通过向劣质小麦粉中添加防腐剂、抗生素和增白剂等非食品原料，掩盖小麦粉质量低劣的事实，使市售小麦粉的感官性状达到出厂标准，这种行为存在很大的食品安全风险，严重危害了广大消费者的身体健康。在这些添加剂中，乙二胺四乙酸二钠属于超范围使用的食品添加剂[1-2]，曲酸、间苯二酚是国家食药总局明令禁止使用的化学成分[3-4]。市售小麦粉中是否添加乙二胺四乙酸二钠、曲酸和间苯二酚等非法添加剂，是评价小麦粉安全性的主要依据，因此研究市售小麦粉中多种非食品原料检测方法非常重要。

本实验采用高效液相色谱法同时对市售小麦粉中乙二胺四乙酸二钠、曲酸和间苯二酚这3 种化合物进行检测分析，探索同时测定小麦粉中多种非法添加剂的方法，为小麦粉的安全性评价及质量监督提供技术支持。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

小麦粉样品48批次，购自哈尔滨市、齐齐哈尔市、绥化市等地的粮油市场。

乙二胺四乙酸二钠（含量：99.0%；批号：20200701），国药集团化学试剂有限公司；曲酸（含量：100.0%；批号：CCFD200382），德国卡特化工有限公司；间苯二酚（含量：99.9%；批号：21071189），坛墨质检-标准物质中心；甲醇（色谱纯）、乙腈（色谱纯），美国Merck 公司；甲酸（色谱纯），DIKMA 公司。

1.2 仪器与设备

2695 型高效液相色谱仪；Watere 2489 型检测器；GP324S 电子天平，Sartorius 公司；DC24H 氮吹仪，安谱科学仪器公司；KQ500VDE 型超声波清洗器，昆山市超声仪器；3K15 型高速冷冻离心机，SIGMA公司。

1.3 实验方法

1.3.1 标准溶液的配制

称取乙二胺四乙酸二钠、曲酸标准物质适量，分别用30%甲醇溶液配制成50.0 μg·mL-1的标准储备液；称取间苯二酚标准物质适量，用80%甲醇溶液配制成50.0 μg·mL-1的标准储备液。移取上述标准溶液适量，用50%乙腈溶液稀释成浓度为0.5 μg·mL-1、1.0 μg·mL-1、2.0 μg·mL-1、4.0 μg·mL-1、6.0 μg·mL-1和10.0 μg·mL-1的系列混合标准溶液。

1.3.2 样品前处理

称取市售小麦粉样品5.0 g，置于聚丙烯离心管中，加入乙腈-甲醇-水溶液（5 ∶4 ∶1）10 mL，振摇混匀后，涡旋混匀10 min，超声处理15 min，8 000 r·min-1离心10 min，获取上清液并置于另一离心管中；再次加入乙腈-甲醇-水溶液（5 ∶4 ∶1）10 mL，重复提取一次，合并两次小麦粉提取液。移取10 mL 提取液，置于带刻度的离心管中，在40 ℃水浴下氮吹至近干，使用50%乙腈溶液复溶以后，定容至2 mL，过0.22 μm 滤膜后进样检测[5-9]。

1.3.3 色谱条件

DiamonsiL-C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；柱 温：40 ℃； 流 速：1.0 mL·min-1； 进 样 体 积：20 μL；流动相：A 为乙腈，B 为0.1%甲酸溶液；检测波长：275 nm；梯度洗脱程序见表1。

表1 梯度洗脱条件

1.3.4 样品测定

小麦粉样品经过前处理后，注入液相色谱分析并计算乙二胺四乙酸二钠、曲酸和间苯二酚的峰面积，以浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，建立3 种化合物的标准曲线，将样品峰面积代入到标准曲线中，计算小麦粉样品溶液中的化合物含量。

2 结果与分析

2.1 流动相的优化

参考文献[10-12]中的色谱条件，改变流动相中乙腈、0.1%甲酸溶液的比例，研究了不同梯度下乙二胺四乙酸二钠、曲酸和间苯二酚的理论塔板数和分离度，结合3 种化合物的保留时间，确定了最佳流动相比例。在这种流动相条件下，3 种化合物的理论塔板数均不小于5 000，各个色谱峰的分离度均不小于1.5，具体结果见图1、图2、图3。

图1 混合标准溶液色谱图

图2 空白样品加标色谱图

图3 空白样品（小麦粉）色谱图

2.2 检测波长的选择

乙二胺四乙酸二钠、曲酸和间苯二酚的紫外吸收峰值不同。间苯二酚和曲酸的最大吸收波长在260 ～280 nm，乙二胺四乙酸二钠的最大吸收波长在250 ～280 nm，为兼顾各个成分的灵敏度，并能实现同时测定的目的，选择275 nm 作为3 种化合物共有的检测波长。

2.3 提取溶剂的选择

根据3 种化合物的溶解性和相关文献资料的报道，选择常用试剂甲醇、50%甲醇、乙醇、50%乙醇、50%乙腈、乙腈-甲醇-水溶液（5 ∶4 ∶1）作为提取溶剂进行比较。结果表明，选择甲醇、乙醇提取小麦粉样品，乙二胺四乙酸二钠的回收率低于70%；选择50%甲醇、50%乙醇和50%乙腈提取小麦粉样品，进样后获得的色谱图中干扰峰较多，专属性不强；选择乙腈-甲醇-水溶液（5 ∶4 ∶1）提取小麦粉样品，离心后上清液清澈透明，色谱图中没有干扰峰，3 种化合物均能获得良好的回收率，可以满足定量检测要求。

2.4 线性范围分析

准确移取3 种化合物的标准系列浓度溶液各20 mL，按照由低到高的浓度依次进样检测，将峰面积（Y）作为纵坐标，将浓度（X）作为横坐标，绘制标准曲线，结果表明，乙二胺四乙酸二钠、曲酸和间苯二酚3 种化合物在0.50 ～10.00 μg·mL-1时，线性关系良好（表2）。

表2 线性范围及检出限结果

2.5 最低检出限

在“1.3.3”的色谱条件下，将标准混合使用液用50%乙腈溶液逐级稀释进样，以3 倍信噪比估算乙二胺四乙酸二钠、曲酸和间苯二酚的最低检出限。由表2 可知，乙二胺四乙酸二钠、曲酸和间苯二酚这3 种化合物的检出限分别为0.006 μg·kg-1、0.005 μg·kg-1、0.003 μg·kg-1，方法的检出限满足质量分析的要求。

2.6 加标回收率实验

为了确定检测方法的回收率，选择清洗后干燥麦粒经粉碎获得的小麦粉作为加标回收率实验的空白基质。分别移取“1.3.1”项下的标准储备液，依次加入5.0 g 空白基质中，按“1.3.2”方法制备浓度为1.0 mg·kg-1、2.0 mg·kg-1、4.0 mg·kg-1的加标样品溶液，每个浓度水平设置6 个平行样。如表3 所示，小麦粉中乙二胺四乙酸二钠、曲酸和间苯二酚3 种化合物的平均回收率在97.2%～99.7%，平均相对标准偏差在1.06%～1.79%，说明回收率良好。

表3 小麦粉中3 种化合物的加标回收率（n=6）

2.7 市售样品测定

采用本方法对市售48 种小麦粉中的乙二胺四乙酸二钠、曲酸和间苯二酚3 种化合物进行测定，结果未检出这3 种化合物，说明检测的小麦粉中不存在乙二胺四乙酸二钠、曲酸和间苯二酚3 种非食品原料的问题。本方法可用于小麦粉样品的快速定量检测。

3 结论

本文建立的高效液相色谱方法可以实现乙二胺四乙酸二钠、曲酸和间苯二酚3 种化合物的有效分离，灵敏度高，线性关系良好，回收率高，且成功应用于市售48 种小麦粉中3 种化合物的分离测定。