一例奶牛气肿疽猝死病例的实验室诊断和分析

苑凤婷，孙斌

（黑龙江八一农垦大学动物科技学院，大庆 163319）

反刍动物气肿疽又名黑腿病、烂腿黄或鸣疽，是由于感染气肿疽梭菌（Clostridium chauvoei）所引起的急性、高热性传染病。气肿疽梭菌是一种革兰氏阳性、产芽孢厌氧菌，具有很强的溶血活性。这种微生物产生至少五种可溶性抗原（毒素），包括氧稳定的溶血素（α）、DNA 酶（β）、透明质酸酶（γ）、氧不稳定溶血素和神经氨酸酶，这些毒素与气肿疽梭菌的致病性有关[1]。按压时肿胀部位有捻发音，有人也将其叫做“鸣疽”[2]。特征性临床症状表现为在动物体肌肉丰满处出现炎性气性肿胀，多伴有跛行，严重时危及生命。反刍动物通过摄入存在于土壤中暴露的病原体气肿疽梭菌孢子，然后诱导细胞坏死、水肿和发热，随后出现跛行和死亡[3]。气肿疽病是一种引起牛、羊和其他家畜肌肉坏死的败血症传染病，死亡率高，在畜牧生产中造成相当大的损失。虽然气肿疽梭菌通常被认为是反刍动物特有的，但已有气肿疽梭菌引起人类疾病的报道。气肿疽病是一种高度致死的败血性传染病，世界各地均有分布，发病率和死亡率均非常高，在干燥炎热的季节发病率高[4]。近年，春冬之际也有牛感染气肿疽发病死亡。气肿疽虽然常发于牛、绵羊和马，但在猪、山羊、犬和猫等其它种类动物上也有发生。在实验动物当中豚鼠最易感染。据国外学者研究，气肿疽在骆驼、印度象等一些野生动物的易感率上也比较突出，而且感染不受日龄限制[5]。至今为止，气肿疽病在我国多个地区以地方性流行趋势发病。当所处周围环境十分恶劣，气肿疽梭菌可形成具有很强存活力的芽孢，在菌体中间或顶端部位，用以抵抗周围不利环境，这种极端的抵抗促成了芽孢的自发产生，有助于孢子在环境中生存并维持一定的数量，甚至包括食品工业。环境中无处不在的各类物种的孢子，它们通常会污染食品，许多物种的孢子以食物腐败和食源性疾病为载体。因此，食品工业投入大量资源来消除孢子用以使食物无菌，特别是用以消除极其危险的孢子，例如肉毒杆菌等。作为专性厌氧菌，梭菌病原体依靠其代谢休眠、耐氧的孢子来传播疾病。然而，这些孢子萌发引起感染然后形成新的孢子，传播感染疾病的分子机制，仍然知之甚少。虽然在枯草芽孢杆菌和炭疽芽孢杆菌中孢子形成和萌发已经得到很好的表征，但在芽孢杆菌和梭状芽孢杆菌之间观察到这些过程的调节存在显著差异，甚至一些保守蛋白质在它们的需求和功能上也表现出差异[6]。

东北某奶牛养殖户2019 年11 月份在3 d 内5头奶牛先后突然死亡。生前无明显异常症状，期间未投喂任何中毒药物与有害草料，水源检查并未发现任何有害成分。未接种任何疫苗。死亡牛全为黑白花经产奶牛，具体年龄不详，食用同批草料。没有进食这批草料的牛没有发生死亡。除草料外，牛群的其它饲料、饮水、圈舍都相同。虽然天气很冷，但牛死后仍迅速臌气。牛群中所有牛都未曾接种过气肿疽梭菌疫苗。病死牛采食的草料来源于上冻时从低洼地收割而来。实验通过对采集病料进行实验室分离培养后，设计目的基因引物并经PCR 扩增，得到的细菌DNA 片段与目的基因片段比较观察是否匹配。最终判定致病菌的种类。

1 材料和方法

1.1 培养基

新鲜10%的绵羊血营养琼脂培养基、上下游引物与琼脂糖购自上海生工；其它常用分子生物学试剂与仪器设备由检测实验室提供。

1.2 试剂盒

Premix Taq 和DNA Marker（2 000）购自TaKaRa公司；琼脂糖凝胶DNA 回收试剂盒购自杭州爱思进生物有限公司。

1.3 细菌分离鉴定

无菌采集病死牛皮下组织、肌肉、心肌、肝脏、肾脏、肠组织、肠内容物和腹腔液，放入无菌离心管中。新鲜10 %的绵羊血营养琼脂培养基按常规方法在实验室制备[7-8]。其它常用试剂与仪器设备由检测实验室提供。将采集的皮下组织、肌肉、心肌、肝脏、肾脏、肠组织、肠内容物和腹腔液依次接种于已经标记好的血琼脂培养基，在焦性没食子酸和氢氧化钠反应缸内完全厌氧环境里进行培养[9]。

1.4 PCR 检测

参考Lane 等[10]研究报道，扩增所分离细菌DNA利用合成扩增细菌16 S rDNA 的通用引物。引物设计如下：

上游引物5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG -3'8-27

下游引物5'-ACGGTTACCTTGTTACGACTT-3'1512-1492

16 S rDNA 分子的大小适中，具有普遍性和高度保守性的功能和结构，以其保守区进行参照，设计出PCR 通用引物，进而扩增出所有细菌的16 S rDNA片段。如果依照可变区设计特异性引物，则可对不同的细菌进行区分[11]。

2 结果与分析

2.1 病理剖检

病死牛尸体臌胀明显，从口鼻内有淡红色泡沫液体流出，阴道、肛门侈开。全身皮下炎性水肿、气肿，呈黄色胶冻状，肌间组织气肿呈蜂窝状。按压体表肿胀部位有捻发音。心肌表面与切面红染，煮肉样坏死。肺淤血水肿，气管粘膜出血红染。肝被膜紧张、边缘钝圆，弥漫性坏死，胆囊肿大充盈绿色胆汁。肾脏被膜紧张、表面光滑湿润粥样且红染，皮质部出血坏死。脾脏柔软，腹腔积液淡红色半透明。剖检变化见图1。

图1 奶牛尸体剖检变化Fig.1 Changes in necropsy of dairy cows

2.2 细菌分离培养结果

在血琼脂培养基厌氧培养24 h 后，血琼脂培养基表面可见透明且具有β 溶血的菌落（图2A），光学显微镜下观察呈杆状，革兰氏染色阳性（图2B），无荚膜，无芽孢。

图2 细菌培养与染色Fig.2 Bacterial culture and staining

2.3 PCR 检测结果

经PCR 扩增，得到的细菌DNA 片段1 600 bp左右，与气肿疽梭菌目的基因片段相符（图3）。

图3 分离菌株16 S rDNA PCR 扩增结果Fig.3 PCR amplification results of the isolated strain 16 S rDNA

3 讨论

3.1 临床诊断与治疗

关于气肿疽病感染的发病机制尚无共识，但发病机制是由致病细菌产生的毒素和神经氨酸酶起重要作用。毒素和神经氨酸酶在气肿疽病感染的发病机制和病理学中的作用以及神经氨酸酶抑制剂在疾病临床治疗中的作用十分重要。传统病原学检查、生化鉴定、血清学、免疫学检测、动物实验等都可用于气肿疽病的临床诊断，可这些方法都存在时间长、特异性和敏感性不高等一系列问题[12]。牛和羊的气肿疽病已经有成熟的疫苗体系，该疫苗由完整的灭活细菌和化学试剂培养上清液组成。目前，鞭毛是唯一有证据表明其参与诱导针对气肿疽病的保护性免疫，并在毒力中起作用的特定抗原。此外，假定气肿疽梭菌产生5 种毒素，包括氧稳定溶血素、氧不稳定溶血素、脱氧核糖核酸酶（DNase）、透明质酸酶和神经氨酸酶。最近发现了一种27 kDa 的溶血素从气肿疽梭菌株C6H 中纯化，但未进一步表征。这些毒素在气肿疽梭菌毒力中的作用尚不清楚[13]。在给豚鼠和公牛分别注射毒素后，研究了气肿疽梭菌毒素在气肿疽病感染的发病机制和病理学中的作用，结果显示毒素在气肿疽病感染的发病机制中起重要作用。显微镜下注射动物的肌肉变得透明化，受影响肌肉有轻度坏死和中性粒细胞浸润。注射毒素的公牛血管退化、坏死、渗入少量中性粒细胞并形成血栓，表明梭状芽孢杆菌毒素可以通过改变起血管内皮作用。公牛腘窝淋巴结呈粉红色均匀物质，淋巴滤泡中心有坏死和中性粒细胞浸润白细胞。脾脏中的小体增生，这归因于毒素引发的体液免疫反应。肝脏和肾脏的充血、出血和退化病灶也归因于毒素。感染后1 到3 天，当将整个细菌注射到牛体内时，白细胞和血小板显着减少，观察到的白细胞减少和血小板减少是由于破坏了外周血中的白细胞和血小板由体内细菌产生的毒素[14]。这些发现与之前的报道相符。

随着生物技术的成熟，云巾宴等[15]分别以nanA、fliA（C）、cctA 作为靶向基因用以检测PCR，根据其敏感性、特异性等方面进行比较，用来筛选出对反刍动物气肿疽梭菌感染更加高效的PCR 检测法，其结果显示，以cctA 作为靶向基因的PCR 检测方法敏感性和特异性都更加高效。可以认为PCR 为气肿疽的诊断提供了特异、敏感的快速检测技术。感染气肿疽病最为有效的治疗办法是及时确诊，并且尽早通过静脉或腹腔注射抗气肿疽的高免血清，在此过程中要注射大剂量青霉素[16]。大量的临床试验已经证明，血清疗法在治疗白喉和破伤风等疾病十分有效，治疗机制是由于神经通过特异性抗体对毒素进行追踪。随后，血清疗法被用于治疗病毒和细菌性疾病，血清疗法的临床作用不仅针对毒素介导的细菌感染，例如白喉和炭疽，同时也适用于肺炎链球菌引起的疾病葡萄球菌、金黄色葡萄球菌、嗜血杆菌b 型流感和脑膜炎奈瑟菌。抗生素引入后，由于抗生素更容易制造且有活性一致，毒性较小，跟多的应用于细菌感染的治疗上[17]。已知细菌会产生溶血素，它可以溶解来自各种动物的红细胞。研究表明，与缺乏溶血素的细菌相比，产生溶血素的细菌对动物的毒性更大[18]。因此，气肿疽梭菌产生的溶血素被怀疑是主要的毒力因子，关于气肿疽梭菌溶血素的产生和表征的报道很少。

3.2 调查与诊断

三天内多头奶牛先后突然死亡且生前无异常症状，牛死后仍迅速臌气。尸体剖检有可见多组织器官急性败血症变化；微生物培养有β 溶血的革兰氏染色阳性杆菌。临床症状与尸体剖检病理变化提示有气肿疽梭菌感染的可能。牛群中所有牛都未曾接种过气肿疽梭菌疫苗，PCR 检测得到的细菌DNA 片段约1 600 bp 左右，与气肿疽梭菌相符。结果表明，经临床观察、流行病学问询、尸体剖检、细菌培养和PCR 检测，死亡原因可确诊为气肿疽梭菌病。病原来源可能就是上冻时从低洼地收割回来的草料，应当对此饲草做病原分离鉴定，以确定病原菌的来源。

3.3 危害性分析

气肿疽病可在土壤里存活时间长达5 年，而且在腐败尸体内可存活3 个月。病原体常附着于草料或土壤上，当反刍动物进食或者通过圈舍围栏等设施的接触后，利用消化道或者皮肤伤口进入体内进而发生感染发病，最终发展为持久传染源。这对野外放牧反刍动物有很大的威胁[19]。许多厌氧产芽孢梭菌物种是致病的，其中一些应用在工业生产上。尽管许多是严格的厌氧菌，但细菌在需氧和生长限制条件下作为多层代谢休眠孢子持续存在。对于许多病原体来说，孢子形式是最常见在宿主之间传播生物体的形式。将孢子引入宿主后，某些蛋白质识别特定信号，诱导孢子萌发并随后长成代谢活跃的细胞。当孢子萌发成具有代谢活性的营养形式时，由此产生的细菌可以定殖宿主，并由于细胞分泌毒素而引起疾病。孢子对许多环境压力源具有抵抗力，这使得它们难以从临床环境中去除。确定产生毒素物种的萌发条件和机制，可以通过抑制孢子的萌发来帮助开发负担得起的治疗某些感染的药物。与传染病无关，用于化学品工业生产的物种中的孢子，阻碍了化学品的最佳生产，因为种群中的营养细胞耗尽。了解丙酮—丁醇—乙醇生产物种中的孢子萌发有助于促进化学品的生产，从而产生更便宜的乙醇燃料。直到最近，梭菌的孢子萌发被认为与枯草芽孢杆菌的萌发相似[20]。

在孢子形成过程中，启动从代谢休眠状态转变为代谢活跃状态所需的因素被构建到孢子中。当孢子响应环境信号时，会刺激萌发。刺激萌发的信号可以是各种小分子，这些萌发剂通过与特定的萌发受体结合来激活萌发。在大多数孢子形成生物中迄今为止研究过，活化的萌发受体将信号传播到对于从核心释放二苯胺（DPA）重要的通道，并使皮质退化。皮质降解导致核心肿胀和进一步水合。最后，从萌发的孢子中长出一个营养细胞，研究主要是在芽孢杆菌中进行的[21]。尽管处于休眠状态，但孢子对使用信号特异性蛋白质刺激恢复营养生长作出反应。通常，萌发剂是在有利于生物体生长的环境中发现的低分子量生物分子。最常见的萌发剂是氨基酸，但其他分子（例如，基于胆固醇的化合物、有机酸、核苷、肽聚糖片段等）已被鉴定。虽然一些孢子的萌发可以由一个简单的萌发剂触发，但一些孢子需要存在不止一种类型的分子来刺激萌发。与在芽孢杆菌中观察到的相似，梭状芽胞杆菌中最常见的萌发剂是L-丙氨酸。L-丙氨酸作为许多孢子形成生物的首选萌发剂的原因尚不清楚，但可能与肽聚糖120 的保守性有关构体[22]。气肿疽病在感染生物体的过程中，孢子的萌发至关重要，使孢子从休眠状态变为活跃状态进而感染细胞。

气肿疽病在1870 年首次报道。现有报告表明，猪、貂、淡水鱼、威尔士和青蛙易受感染，虽然人类、鸟类、猫、狗和兔子被认为对它有抗药性，但这种细菌已从猫和狗的伤口和母鸡的伤口分离出来，疫苗接种是最可靠的预防疾病的方法。1929 该病在尼日利亚报道，并且一直是该国牛群的主要问题。虽然疫苗接种没有中断过，但每年都有零星的病例爆发记录。该疾病在尼日利亚被列为“A 类疾病”，是该国牛年死亡率高的疾病之一。由于气肿疽梭菌病造成的经济损失尚未量化，但考虑到由此造成的反刍动物的高年死亡率，它的经济损失十分巨大。2006年，日本千叶县报道了全球首例人类感染气肿疽菌死亡病例之后，2011 年美国也发布了人感染气肿疽梭菌死亡病例。由此使得该病迅速被各国人医和兽医列为共同关注和研究的焦点。这预示着气肿疽梭菌病不但给动物健康安全造成了巨大的危害，同时也逐渐地影响到公共卫生安全，进而威胁到人类的健康和安全[23]。

3.4 防控措施

对动物进行系统性接种疫苗和类毒素组合疫苗是最有效的控制气肿疽病的措施，可以明显降低发病率和死亡率。应从低日龄的动物开始进行疫苗接种，于4~6 周后再接种免疫，至少每年要加强免疫接种疫苗一次[24]。疫苗大大减轻了传染病的负担，在降低全球死亡率方面仅次于清洁饮用水。免疫是一种具有成本效益的策略，不仅可以保护接种疫苗的个体，还可以通过产生群体免疫间接保护周围环境[25]。应该建立系统的疫病防御措施，早期预警系统是预防传染病传播的基础，风险评估方法和其他临时建模技术，很大程度上可以有效预测传染病在不同地理区域引入和传播的概率。在此过程中，必须建立有效的信息系统，在发生流行病紧急情况时协助兽医服务，支持迅速采取措施来控制感染，减少负面后果的严重程度[26]。同时积极宣传对气肿疽病的防控知识，让人们认识到其危害、掌握基本的防治措施。做好环境、器具设施、圈舍、运输工具的消毒。患病动物、可疑动物及时隔离治疗或扑杀，病死动物应按国家标准实施深埋、焚烧等无害化处理[27]。对患病及死亡动物已经污染圈舍、周围牧道、排泄物及被污染的草场、畜群养殖场及周边设施进行彻底消毒以及无害化处理。不到疫区去放牧、收草，不使用被患病动物污染的器具。被污染的草场、畜群养殖场及周边设施严格消毒后，短时间内（5 年）禁严任何畜群入内。严格规范疫苗接种、无菌操作。畜群有发病现象时应该马上采取全面封闭、逐个排查，患病动物进行严格的封闭隔离诊治，对疑似病例实施严密监视，患病及病死动物严禁私自转移或贩卖食用。没有患病的畜群紧急接种气肿疽梭菌疫苗。发现气肿疽疫情，立即将疫情信息上报到相关兽医主管部门。

从多方面对气肿疽病进行疫病的防御和管控，及时在未发病的临近地带做好档案记载和疫苗接种，以防突然发病，并做好防范措施。在已经发病的区域，做好隔离、诊治、扑杀、掩埋和封锁，并且做好档案记录，归纳总结出快速的疾病应急方案，为今后的疫病防治打好基础。

4 结论

本次病例发生在寒冬季节，经现场观察、流行病学调查、病死牛临床症状观察、病死牛尸体剖检、微生物培养和分子生物学检查等确诊为奶牛气肿疽病。