正压防护头罩消毒效果评价方法研究

孟轲音，张珊珊，骆万博，卜昭阳，姚 腾，万忠海，杜 鹏，刘 军

（军事科学院军事医学研究院军事兽医研究所，长春 130118）

0 引言

近年来，世界各国频频应对传染性非典型肺炎（severe acute respiratory syndrome，SARS）、高致病性禽流感、埃博拉病毒病、新型冠状病毒感染等高致病性病原微生物导致的突发性疫情，为了保证实验人员健康安全，个体防护装备的选择和使用成为了风险评估的重点。正压防护头罩因其可有效防护经呼吸道吸入或黏膜接触导致个体风险的病原及对面部可形成全封闭防护等优点[1]逐步取代了给视野带来不便的护目镜，被高等级生物安全实验室的实验人员广泛使用。正压防护头罩在高等级生物安全实验室主要应用于核心间的实验操作中，且非一次性使用产品，这就要求实验人员在核心间完成实验操作后需对其进行消毒处理，以备下次实验使用，而消毒剂的选用及最佳作用时间需要通过消毒效果验证实验加以验证。目前，国内外尚无专门针对高等级生物安全实验室用正压防护头罩消毒效果评价的统一方法。本试验旨在研究卫可消毒剂在不同作用时间对正压防护头罩上犬流感病毒（canine influenza virus，CIV）消毒效果的评价方法，探索出一套相对科学完整的正压防护头罩消毒效果评价方法，为在高等级生物安全实验室开展正压防护头罩承载不同烈性病原消毒条件的确立实验提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 病毒株和细胞株

试验用CIV H3N2 亚型重组疫苗株[A/Canine/Qiaoke32Q-PR8/2019（H3N2）]和犬肾细胞（madin darby canine kidney cell，MDCK）均由军事兽医研究所病毒学研究室提供。

1.1.2 鸡胚

试验用鸡胚为无特定病原体（specific pathogen free，SPF）级鸡种蛋，购自北京勃林格殷格翰维通生物技术有限公司，于37 ℃温室条件孵化至9 日龄。

1.1.3 试剂和材料

试验用试剂如下：病毒基因组RNA 提取试剂盒、cDNA 反转录试剂盒，购自天根生化科技（北京）有限公司；实时定量聚合酶链式反应（real-time quantitative polymerase chain reaction，RT-qPCR）试剂盒，购自依科赛生物科技有限公司；酶联免疫吸附测定（enzyme-linked immuno sorbent assay，ELISA）试剂盒，购自上海纪宁生物技术有限公司；胎牛血清、DMEM（Dulbecco’s modified eagle medium）培养基，购自美国Gibco 公司；杜邦卫可消毒剂，购自上海科慕宠物有限公司；磷酸缓冲盐溶液（phosphate buffered saline，PBS），购自海克隆生物化学制品（北京）有限公司；0.9%生理盐水，购自中国国药集团；引物，购自生工生物工程（上海）有限公司；其他试剂均购自Sigma公司。

试验用材料如下：正压防护头罩，购自美国3M公司；1 mL 喷雾瓶，购自濮阳市鲁蒙玻璃制品有限公司；一次性灭菌规格板，购自上海科慕宠物有限公司。

1.1.4 仪器

试验用仪器如下：Nano Drop 微量蛋白核酸仪、Thermo 酶标仪，购自赛默飞世尔（上海）科技公司；荧光定量RCR 仪，购自美国伯乐公司；台式高速离心机，购自德国Sigma 公司；漩涡仪，购自德国IKA 公司；超净工作台，购自北京亚泰科隆公司；超纯水仪，购自艾柯仪器公司。

1.2 方法

1.2.1 病毒滴度测定

用含2%胎牛血清的DMEM 培养基将CIV 进行连续10 倍稀释并吹打混匀，再将稀释好的病毒接种于96 孔培养板中（每一稀释度8 个重复孔），之后置于37 ℃培养箱中孵育。逐日观察并记录细胞病变情况，然后用Reed-Muench 法计算半数组织培养感染剂量（TCID50）。

使用鸡胚进行病毒滴定时，将病毒液10 倍倍比稀释后，每个稀释度接种3 个鸡胚，之后在37 ℃培养箱中培养2～3 d，然后吸出尿囊液，用1%鸡红细胞检测血凝结果，计算鸡胚半数感染量（EID50）。

1.2.2 中和剂鉴定试验

依照《消毒技术规范》（2002 版）规定的程序进行中和剂鉴定试验。本试验消毒剂为1%卫可消毒剂，中和剂为0.1%卵磷脂+2%吐温80+0.5%硫代硫酸钠PBS[2]。试验按样品不同分为8 组：第1 组为CIV；第2组为卫可消毒剂+CIV；第3 组为（卫可消毒剂+CIV）+PBS；第4 组为（卫可消毒剂+PBS）+CIV；第5 组为PBS+CIV；第6 组为PBS+MDCK；第7 组为（卫可消毒剂+PBS）+MDCK；第8 组为MDCK。本试验消毒剂均作用10 min。将第1～5 组分别接种MDCK，观察并记录细胞病变情况，计算各组病毒滴度并进行比较。评判标准为：第2、3 组无病毒检出或有少量病毒；第4、5 组病毒生长与第1 组相近；第6、7、8 组细胞正常生长，无病毒检出。每组试验均重复3 次。

1.2.3 病毒载体及环境对病毒活性的影响试验

将试验分为8 组。选取正压防护头罩较平整位置分别圈定8 块3 cm×3 cm 的正方形小块，用移液器各吸取200 μL CIV 悬液均匀涂抹其上，分别静置30 s、1 min、2 min、3 min、4 min、5 min、10 min、15 min后[3]，用含2%胎牛血清的DMEM 培养基浸湿的棉签涂抹采样，每块往返取样各10 次。采样后，将棉签采样端剪入含2%胎牛血清的DMEM 培养基中分别接种MDCK，观察并记录细胞病变情况，计算病毒滴度。每组试验重复3 次。

1.2.4 病毒灭活试验

1.2.4.1 病毒载体模型建立

将正压防护头罩剪裁成面积为4 cm×4 cm 的若干片，并将市购3 cm×3 cm 灭菌规格板放置在裁剪后的正压防护头罩上备用。

1.2.4.2 病毒浸染与采样

将试验按消毒时间不同分为8 组，每组取200 μL CIV 悬液，用移液器轻轻均匀涂抹于病毒载体模型上，各喷洒800 μL 卫可消毒剂，分别作用30 s、1 min、2 min、3 min、4 min、5 min、10 min、15 min，达到作用时间后分别加入中和剂，用含2% 胎牛血清的DMEM 培养基浸湿的棉签涂抹采样，每组往返取样各10 次。采样后，将棉签采样端剪入含2%胎牛血清的DMEM 培养基中，旋涡振荡1 min 备用。再用0.9%生理盐水浸湿的棉签涂抹采样，每组往返取样各10次后，将棉签采样端剪入0.9%生理盐水，旋涡振荡1 min，备用。

1.2.4.3 病毒回收率测定

本试验采用RT-qPCR 法和ELISA 法验证病毒回收率。取样方法依照1.2.3 节采样方法进行。RT-qPCR试验及引物设计依据GB/T 27539—2011《动物流感检测A 型流感病毒通用荧光RT-PCR 检测方法》进行；ELISA 试验根据试剂盒说明书进行。

1.2.4.4 消毒效果验证

将1.2.4.2 节采集的样本按1.2.1 节方法分别接种MDCK 和鸡胚，观察并记录细胞和鸡胚病变情况，计算TCID50和EID50。每组试验重复3 次。

2 结果

2.1 中和剂鉴定试验结果

试验结果显示，试验组2 和试验组3 未有病毒检出；试验组4 和试验组5 病毒滴度（TCID50）对数值与CIV 原液病毒滴度（TCID50）对数值差异无统计学意义；试验组6、试验组7 和试验组8 细胞正常生长（见表1）。表明0.1%卵磷脂+2%吐温80+0.5%硫代硫酸钠PBS 能有效中和1%卫可消毒剂，且对细胞生长无影响。

表1 中和剂鉴定试验结果（N=3）

2.2 病毒载体及环境对病毒活性的影响试验结果

试验结果显示，在同一环境条件下，CIV 在正压防护头罩上作用30 s、1 min、2 min、3 min、4 min、5 min、10 min、15 min 后病毒滴度（TCID50）对数值分别为5.95、5.96、5.94、5.95、5.96、5.95、5.93，与CIV 原液病毒滴度（TCID50）对数值差异无统计学意义（如图1 所示）。表明该试验环境及正压防护头罩载体本身对CIV 活性无显著性影响。

图1 CIV 病毒滴度对数值

2.3 病毒灭活试验结果

2.3.1 病毒回收率测定结果

接种细胞前样本回收ELISA 试验结果显示，试验组1、试验组2、试验组3 的CIV M1 蛋白质量浓度分别为12.31、9.01、8.95 ng/mL，其他5 个试验组的CIV M1 蛋白质量浓度均为0.00；RT-qPCR 试验结果显示，试验组1、试验组2、试验组3、试验组4、试验组5、试验组6、试验组7、试验组8 的循环数阈值（cycle threshold，Ct）分别为6.31、6.33、6.64、6.30、6.32、6.33、6.31、6.32，与CIV 原液的Ct 差异无统计学意义。经计算，瞬时平均回收率为96.12%（如图2 所示）。

图2 接种细胞前样本回收率检测结果

接种鸡胚前样本回收ELISA 试验结果显示，试验组1、试验组2、试验组3、试验组4 的CIV M1 蛋白质量浓度分别为13.01、10.01、9.51、8.71 ng/mL，其他4 个试验组的CIV M1 蛋白质量浓度均为0.00；RT-qPCR 试验结果显示，试验组1、试验组2、试验组3、试验组4、试验组5、试验组6、试验组7、试验组8 的Ct 分别为6.01、6.02、5.97、5.99、6.00、6.01、5.98、6.03，与CIV 原液Ct 差异无统计学意义。经计算，瞬时平均回收率为95.98%（如图3 所示）。

图3 接种鸡胚前样本回收率检测结果

试验表明，未灭活病毒回收率和病毒整体回收率均能有效得到保障，进一步确保了正压防护头罩消毒效果验证方法的可靠性。

2.3.2 消毒效果验证

试验结果显示，卫可消毒剂作用CIV 30 s、1 min、2 min、3 min、4 min、5 min、10 min、15 min 分别接种细胞后，病毒灭活对数值分别为4.01、4.54、4.79、6.00、6.00、6.00、6.00、6.00（如图4 所示），即消毒时间超过3 min 后，可百分之百灭活病毒；接种鸡胚后，病毒灭活对数值分别为3.35、4.34、4.67、4.86、6.00、6.00、6.00、6.00（如图5 所示），即消毒时间超过4 min 后，可百分之百灭活病毒。

图4 样本接种在细胞中消毒效果验证结果

图5 样本接种在鸡胚中消毒效果验证结果

综上表明，1%卫可消毒剂灭活正压防护头罩上CIV 的最佳作用时间为4 min。

3 讨论

高等级生物安全实验室是专门从事烈性病原研究的实验室，是指防护等级为三级和四级的实验室[4]。实验期间，为了防止生物因子泄漏及保证实验人员安全，实验室需在达到很高气密性的同时，还要通过空调和自控系统使其始终保持相对大气环境一定数值的负压[5]。长时间在负压环境中工作会对实验人员健康带来不利影响，因此在高等级生物安全实验室开展实验工作需限制其最长工作时间，一般为4 h。这就要求实验工作除了应有合理的实验设计、熟练的操作技术外，与之配套的个体防护装备的穿脱、消毒灭菌等环节也应科学合理，这样才能有效节约实验人员在高等级生物安全实验室的工作时间。本研究提出的正压防护头罩消毒效果评价方法正是解决此问题的一个关键环节。

为了建立一套可供同行参考的科学严谨的正压防护头罩消毒效果评价方法，本研究将可能对消毒效果产生影响的诸多因素进行了逐一研究，包括中和剂鉴定试验、病毒载体及环境对病毒活性影响试验、病毒灭活试验（包括病毒回收率测定、消毒效果验证）等。在消毒效果验证试验中，中和剂的选择至关重要[6]，选择正确有效的中和剂能瞬时终止消毒剂消毒功能，以确保此时间节点评价消毒剂作用效果的准确性，而中和剂的选择则是依据消毒剂成分来确定的，本试验选择的是卫可消毒剂，成分中含氯＞10%，因此根据《消毒技术规范》（2002 版），选择含0.1%卵磷脂+2%吐温80+0.5%硫代硫酸钠PBS 作为中和剂。另外，试验载体及外界环境因素及采样方法对试验本身也可能产生巨大影响[7]，本试验为了模拟实验人员退出核心间时对正压防护头罩喷洒消毒的过程，同时尽量减少和消除其他因素对试验的影响，进行了反复验证，即将正压防护头罩进行剪裁，作为试验载体，在其上放置一次性无菌规格板以减少实验误差，在规格板中涂抹病毒后，用微量型喷洒器喷洒消毒剂。另外，在选择病毒毒株上也进行了充分考虑，选择了既可在细胞中增殖，又可在鸡胚中增殖的CIV 疫苗株作为试验毒株，成功复刻正压防护头罩喷洒消毒的环境。

卫可消毒剂对病毒的杀灭原理是瞬时破坏病毒的蛋白结构[8]，继而影响病毒的复制，但短时间内不会破坏核酸结构，因此本试验选用RT-qPCR 法及ELISA 法对样本回收率进行验证[9-10]。ELISA 试验结果表明，CIV M1 蛋白质量浓度随灭活时间的增加而降低，与病毒滴度测定结果趋势一致，说明活病毒回收率基本能够得到保障；经RT-qPCR 试验结果计算的病毒接种细胞和鸡胚瞬时平均回收率均达95%以上，差异无统计学意义，进一步确保了正压防护头罩消毒效果验证方法的可靠性。

为确保首次开展正压防护头罩消毒效果验证方法探索的经济性和安全性，本试验未选用在高等级生物安全实验室操作高致病性病原微生物。在本试验成功建立正压防护头罩消毒效果评价方法的基础上，下一步将继续在高等级生物安全实验室开展烈性病原消毒效果验证本研究，为正压防护头罩确立最佳消毒条件。