松墨天牛对小蠹危害后马尾松挥发物的气相色谱-触角电位联用技术反应1)

杨梦君 鲁进韬 许原 陈晓 杨振德 熊运凡 胡平

(广西高校亚热带人工林培育与利用重点实验室(广西大学),南宁,530004)

松墨天牛(MonochamusalternatusHope)又称松褐天牛,属鞘翅目(Coleoptera)、天牛科(Cerambycidae)、墨天牛属(Monochamus)。松墨天牛是松树重要的蛀干害虫,同时也是全球毁灭性森林病害——松材线虫病的主要传播媒介,对我国马尾松(PinusmassonianaLamb.)、油松(PinustabuliformisCarrière)、华山松(PinusarmandiiFranch.)、落叶松(LarixgmeliniiKuzen.)和雪松(CedrusdeodaraG. Don)等多种松树造成严重危害,造成松林大面积死亡[1-2]。防止松材线虫病蔓延的主要途径之一是防控媒介昆虫松墨天牛。常用的防控手段有及时清理枯死树木、喷洒化学药剂等,而在天牛的监测上,植物源引诱剂扮演了重要角色。已有研究表明,添加了植物源挥发物的诱芯能显著提升对天牛的诱捕效果[3]。因此,厘清松树挥发物中的引诱活性物质对松墨天牛的防控具有重要意义。

植物挥发物是指植物的地上部分散发产生的挥发性有机化合物(VOCs),主要为萜类、醇、醛、酯类化合物。大多数寄主植物受到害虫的侵害时,会改变挥发性组分的种类、比例、浓度,这些虫害诱导挥发物(HIPVs)可影响昆虫的行为,例如,棉花(Gossypiumspp.)被海灰翅夜蛾(SpodopteralittoralisBoisduval)取食后,诱导产生的4,8-二甲基-1,3,7-壬三烯会抑制成虫的交配和产卵行为[4];马铃薯甲虫(LeptinotarsadecemlineataSay)的成虫可被其幼虫危害后的马铃薯(SolanumtuberosumL.)植株所吸引[5]。此外,虫害诱导挥发物对于同寄主的不同植食性昆虫也会产生一定的影响,有研究发现,受到蚜虫(MacrosiphumeuphorbiaeThomas)危害的番茄(SolanumlycopersicumL.)植株更能吸引甜菜夜蛾(SpodopteraexiguaHvbner)取食[6]。本课题组在对感染松材线虫病初期和中期的马尾松进行调查时发现,在同时遭受松树材小蠹(X.festivusEichhoff)危害的马尾松嫩梢上极易发现被松墨天牛取食的痕迹。有试验证明,未交配的松墨天牛成虫对于受害马尾松挥发物呈负趋性[7],据此推测,受小蠹蛀干危害的马尾松枝挥发物能吸引松墨天牛成虫前来取食,小蠹与松墨天牛存在协同危害的可能。本研究采用动态顶空吸附法收集受小蠹危害的马尾松侧枝与其生长端上的1年生松嫩梢的挥发性组分,利用气相色谱-质谱联用技术(GC-MS)和气相色谱-触角电位联用技术(GC-EAD)初步鉴定其组分,并筛选出对松墨天牛有触角电生理反应的物质,为综合防治松墨天牛提供参考。

1 材料与方法

供试植物：本试验在广西南宁兴宁区(地理中心坐标为108°22′13.6″E,22°54′7.5″N),对3棵已经感染松材线虫病的马尾松病株(图1-A,B,C),采集受到松树材小蠹危害的侧枝,以及其生长端的当年生绿色嫩梢(图1-D,E,F),侧枝截面直径约6 cm,长度约30 cm,当年生松梢长度约40 cm。将采集后的植物材料装入保鲜密封袋内保湿,带回实验室备用。

A、B、C为马尾松病株;D为被松墨天牛取食的嫩梢;E为被松树材小蠹危害的侧枝;F为1年生松嫩梢样品。

供试虫源：松墨天牛采自广西南宁兴宁区,收集受害的马尾松主干木段,带回实验室隔离饲养,待成虫羽化后,装入塑料杯内,用新鲜马尾松枝条饲养。以未交配的雌虫和雄虫为供试虫源。

植物挥发物的收集：采用动态顶空吸附法收集受害的马尾松侧枝和嫩梢的挥发物,将两者分别放入聚对苯二甲酸乙二酯烘烤袋(江苏申凯包装高新技术股份有限公司,中国)内,利用QC-1S型大气采样仪(北京劳动保护研究所)进行抽提,进气口连接活性炭,出气口连接填充了Porapark Q吸附剂(80/100目,Alltech,美国)的石英玻璃管,通过聚四氟乙烯软管连接收集袋、活性炭、玻璃管、流量计(LZB-3WB)和大气采样仪,做好各部分连接的密封。先将袋内空气抽走,泵入活性炭过滤后的净化空气,气体流量为400 mL/min,密封循环采气6 h,采集均设3个重复。采集完成后,使用正己烷(色谱纯)对玻璃管内吸附的物质进行洗脱,随后将洗脱液迅速放入冰箱-20 ℃保存。

挥发物组分测定：采用气相色谱-质谱联用仪(GC-MS,7890B-7000D,安捷伦科技有限公司,美国)对受害后的马尾松挥发物洗脱液进行组分分析。气相色谱配备HP-5毛细管柱,每次进样量为1 μL,进样口温度为250 ℃,不分流模式,检测器温度为300 ℃,载气为He(1 mL/min)。升温程序设置为先以10 ℃/min的速度升温到80 ℃,再以3 ℃/min升温到110 ℃,然后以5 ℃/min升温到160 ℃,保持3 min,共运行30 min。质谱仪电离方式为电子电离(EI),能量为70 eV,离子源发生器温度250 ℃,Scan扫描模式,质量扫描范围质荷比(m/z)为30～350。

松墨天牛对挥发物的触角电位反应：气相色谱-触角电位联用仪(GC-EAD,7890B-IDAC4,安捷伦科技有限公司,美国;Styntech公司,德国)载气为高纯度N2(1 mL/min),分流比1∶1。其余条件设置同气相色谱-质谱联用仪。

使用手术刀将前期饲养的天牛雌、雄成虫各一个触角从基部切下,切除端节的少许末梢,用导电胶(spectra 360 Electrode,德国)将触角两端粘到金属电极的两极,最后将电极插入触角电位仪探头处,使用气相色谱-触角电位联用仪1.2.5软件同时放大并记录触角电位(EAG)和氢火焰离子化检测器(FID)信号。试验雌雄成虫各3头,每个触角测试重复3次。

数据处理：数据采用Agilent Mass Hunter Qualitative Analysis (B.07.00)软件,根据各色谱峰对应的质谱图,连接由美国国家标准与技术研究院建立的NIST 17标准质谱库,进行检索分析各组分的质谱数据,选取质谱匹配度高的化合物,定量分析采用峰面积百分比法确定各成分的相对质量分数。通过与气相色谱-触角电位联用仪、气相色谱-质谱联用仪峰图上的化合物峰形和保留时间进行对比,鉴定出具有电生理反应的物质。

2 结果与分析

2.1 受害马尾松侧枝与嫩梢挥发物的成分与相对质量分数

对马尾松挥发物采用气相色谱-质谱联用仪分析,其总离子流图见图2,具体的物质见表1。从马尾松侧枝与嫩梢中检测出的24种化合物以萜烯类居多,共21种,其中单萜化合物有9种,倍半萜化合物有12种,还有极微量酮类和酯类。侧枝与嫩梢挥发物组分不同,嫩梢中含有20种,主要有α-蒎烯(57.93%)、左旋-β-蒎烯(15.26%)、假柠檬烯(13.15%)、莰烯(3.12%)、长叶烯(2.09%)、萜品油烯(2.02%)等;侧枝中含有16种,相对质量分数较高的为α-蒎烯(76.32%)、莰烯(5.03%)、右旋萜二烯(5.14%)、长叶烯(4.47%)、左旋-β-蒎烯(3.61%)等。侧枝和嫩梢中含有的相同组分为α-蒎烯、莰烯、左旋-β-蒎烯、月桂烯、萜品油烯、别罗勒烯、(+)-α-长叶蒎烯、(+)-环苜蓿烯、(+)-长叶环烯、(+)-苜蓿烯、长叶烯、β-石竹烯;不同的组分为右旋萜二烯、假柠檬烯、3-蒈烯、乙酸芳樟酯、3-乙基苯乙酮、左旋乙酸冰片酯、罗汉柏烯、(-)-α-可巴烯、β-波旁烯、β-榄香烯、β-可巴烯、大根香叶烯-D。两个部位化合物组分的相对质量分数也不同,差别较大的物质有α-蒎烯、左旋-β-蒎烯、右旋萜二烯、假柠檬烯和长叶烯;嫩梢中,左旋-β-蒎烯和假柠檬烯相对质量分数较高;侧枝中,α-蒎烯、右旋萜二烯和长叶烯相对质量分数较高。本次嫩梢中检测到的挥发性组分占到总离子流的98.01%,侧枝为97.61%,剩余组分为少量杂质和柱流失。

表1 受害马尾松嫩梢与侧枝的挥发物成分及其相对质量分数

续(表1)

图2 马尾松挥发物气相色谱-质谱联用仪总离子流图

2.2 松墨天牛成虫对受害马尾松挥发物的GC-EAD反应

由图3可知,利用雌、雄成虫触角筛选得到的活性物质是一致的。嫩梢中筛选出的有效物质有7种,分别是α-蒎烯、莰烯、左旋-β-蒎烯、假柠檬烯、萜品油烯、长叶烯、β-石竹烯;马尾松侧枝中筛选出的有效物质有5种,分别是α-蒎烯、莰烯、左旋-β-蒎烯、右旋萜二烯、长叶烯。

A为对嫩梢的GC-EAD反应。其中,1为α-蒎烯;2为莰烯;3为左旋-β-蒎烯;6为假柠檬烯;8为萜品油烯;21为长叶烯;22为β-石竹烯;a为柱流失;♀为雌性成虫;♂为雄性成虫。B为对侧枝的GC-EAD反应。其中,1为α-蒎烯;2为莰烯;3为左旋-β-蒎烯;5为右旋萜二烯;21为长叶烯;b为柱流失;♀为雌性成虫;♂为雄性成虫。

2.3 马尾松健康与感病感虫植株挥发物组分以及松墨天牛GC-EAD反应的比较分析

通过对比一些健康马尾松挥发物的相关研究结果[8-12],相对质量分数较高的化合物组分中,除了假柠檬烯与右旋萜二烯,其余组分种类基本一致。目前针对松墨天牛与寄主马尾松之间的化学通讯已有很多研究结论,松墨天牛对健康马尾松挥发物的触角电位反应试验筛选得到的物质有α-蒎烯、β-蒎烯、水芹烯、石竹烯、月桂烯、β-月桂烯、萜品油烯、长叶烯、异己烯、雪松烯、乙酸龙脑酯等[13-14]。本次GC-EAD试验中初步筛选出的活性组分共有8种,除了右旋萜二烯,其余7种组分都存在于嫩梢的挥发物中,将筛选结果与前人研究进行对比发现,健康马尾松与受害后马尾松挥发物存在相同的组分,如α-蒎烯、萜品油烯、长叶烯,同时也发现,在健康马尾松的挥发物组分中存在左旋-β-蒎烯,但相对质量分数较低,未能被筛选为活性物质,而在本试验中,受害后马尾松左旋-β-蒎烯相对质量分数较高,故能被筛选出来。

3 结论与讨论

利用气相色谱-质谱联用仪对受松树材小蠹危害后的马尾松侧枝与嫩梢中的挥发物进行检测,共鉴定得出24种化合物,其中87.5%为萜烯类。通过与健康松树挥发物的对比发现,相对质量分数较高的组分只有假柠檬烯与右旋萜二烯不同,推测这两种物质或与小蠹危害有关。松墨天牛的寄主包含多种松科树种,例如云南松(PinusyunnanensisFranch.)、黑松(PinusthunbergiiParl.)、樟子松(Pinussylvestrisvar.mongholicaLitv.)以及红松(PinuskoraiensisSiebold &Zucc.)等[15-18],单萜和倍半萜类化合物常存在于这类植物的挥发物中。如云南松松针的挥发物组分有α-蒎烯、β-蒎烯、柠檬烯、萜品油烯、β-榄香烯、石竹烯、α-石竹烯等[15],黑松松梢的挥发物组分有α-蒎烯、莰烯、β-蒎烯、β-水芹烯、柠檬烯、α-萜品油烯、异长叶烯等[18]。萜烯类化合物是植物挥发物中一类重要化合物,它使植物可与其周边环境及生物保持互作关系,因此,松类植物挥发性的萜烯类物质在与松墨天牛的化学通信中有重要作用。

有试验在对比了健康松梢挥发物与取食危害后挥发物的组分,以及使用标准样品进行触角电位(EAG)测试后得出,α-蒎烯、β-蒎烯、β-水芹烯和β-月桂烯为重要的活性物质[19]。并且有研究证明,松墨天牛对寄主松树挥发物中的α-蒎烯、β-蒎烯、莰烯、月桂烯、柠檬烯、萜品油烯、β-石竹烯、β-水芹烯均可产生电生理活性[13,20-22],结合这些相关研究,本试验中,雌成虫与雄成虫气相色谱-触角电位联用技术(GC-EAD)所筛选的活性物质在影响天牛行为方面有不可忽视的作用。

松墨天牛对松树挥发物中的α-蒎烯、β-蒎烯、莰烯、β-水芹烯、右旋萜二烯、β-石竹烯等萜烯类物质都具有显著的趋向性[21,23]。其中,衰弱松树挥发物中的(+)-α-蒎烯对松墨天牛有很好的引诱效果[24]。本试验筛选得到的活性组分中,α-蒎烯、莰烯、左旋-β-蒎烯、右旋萜二烯和β-石竹烯很可能会吸引松墨天牛进行取食或产卵。此外,有研究表明,月桂烯可显著吸引松墨天牛并且促进其取食[25-26];在进行松墨天牛的田间诱捕试验中发现,(+)-3-蒈烯可诱捕到雌雄两性天牛[27];与松墨天牛同属于沟胫天牛亚科的云斑天牛(BatocerahorsfieldiHope)成虫取食定位寄主野蔷薇的特异成分为3-蒈烯[23]。由于昆虫触角电位反应程度与挥发性化合物浓度有一定关系,虽然我们没有筛选出月桂烯和3-蒈烯作为活性物质,但上述关于这两种化合物组分的行为试验证明其是有相关研究价值的,因此,对于本试验中其他微量组分也可根据情况做进一步探究。

从种间关系的角度考虑,小蠹虫蛀干危害影响了树体内的物质运输,导致树脂分泌减少,这使得松墨天牛可以更好地取食松梢,两物种存在一定的协作关系。松墨天牛作为松材线虫的传播媒介,在未达到性成熟时取食枝叶,体内携带的松材线虫便有机会通过取食的伤口进入树体危害,故本次试验针对未交配成虫的活性物质筛选能有效帮助诱捕成虫,这将更有助于减少松材线虫病的扩散发生。虽然应用气相色谱-触角电位联用技术帮助筛选出了这些活性成分,但目前仍无法确定它们对于天牛是产生吸引还是趋避作用。此外,未交配的雌雄成虫在取食寄主时是否存在差异尚未确定。因此仍需要进一步进行行为试验,以探究这些活性物质的吸引或趋避作用,以及雌雄成虫的取食选择差异。

综上所述,本次所收集并鉴定的受害马尾松挥发性化合物中,假柠檬烯和右旋萜二烯两种成分可能与小蠹危害有关;而α-蒎烯、左旋-β-蒎烯、莰烯、右旋萜二烯和β-石竹烯则可能在吸引天牛取食或产卵方面发挥重要作用。然而,对于假柠檬烯的作用有待进一步探究。鉴于天牛在未性成熟时取食就可能导致松材线虫病的传播,今后的研究应集中在如何利用挥发性化合物来吸引并刺激天牛进行取食。随后的室内行为试验将进一步筛选有效吸引未性成熟松墨天牛的物质。