转录因子Ascl1诱导体细胞重编程为神经元的研究进展*

张莹丹, 陈 莉

广西医科大学第一附属医院神经内科,南宁 530021

细胞重编程是指分化的细胞在特定条件下被重新编程恢复到全能状态,或者转分化成另一种细胞类型的过程[1]。导入外源性特定神经元决定基因(neuronal determination genes)到非神经元细胞中表达(即异位表达),可将非神经元细胞直接重编程为具有功能的诱导神经元(induced neurons,iNs),从而改善神经功能,为神经系统疾病提供了新的治疗策略[2-4]。其中,神经母细胞特异性转移因子——Achaete-scute家族bHLH转录因子1(achaete scute homolog-1,Ascl1)及其相关的重编程机制在指导终末分化的非神经元细胞重编程为诱导神经元的研究中取得突破。本文将主要围绕Ascl1重编程神经元这一主要科学问题,就Ascl1对不同非神经元细胞的重编程及其机制进行阐述。

1 Ascl1重编程非神经元细胞为神经元的可行性

1958年,Gurdon等[5]将非洲爪蟾胚胎晚期的细胞核移植到卵细胞中,使移植后的卵细胞获得了细胞全能性,表明终末分化细胞的基因状态不是静止的,推翻了细胞分化是不可逆过程的理论,为细胞重编程研究的发展打下基础。特定因子的异位表达如骨骼肌调节的关键转录因子MyoD可将成纤维细胞(fibroblast,Fb)重编程为成熟的肌细胞[6],这表明可能存在着特定谱系调节因子影响细胞发育和分化。

Ascl1是碱性螺旋-环-螺旋(basic-helix-loop-helix,bHLH)转录因子家族中的一员,该家族在神经源性命运决定(neurogenic fate determination)中起着重要作用[7]。Ascl1基因位于12号染色体长臂22区至23区上,其蛋白主要由两组极性氨基酸残基和位于第118～170号氨基酸序列组成的典型的碱性螺旋-环-螺旋结构域构成,可以与目的基因启动子的E-box模块结合,促进神经相关基因的转录活性,主要在发育中的神经系统中表达[8];Ascl1在神经发育过程中有助于γ-氨基丁酸能中间神经元的产生,参与了前脑发育过程中神经决定(neural determination)和神经元表型的确定,也在泛神经发生(panneurogenic)和神经元亚型决定中起着重要作用[9-10],并且对小脑、脊髓及视网膜等特定的细胞亚型也有着多重贡献[11]。此外,Ascl1在中枢神经系统的异位表达可以改变神经祖细胞的分化方向,从而调控细胞命运[9]。

Heins等[12]发现神经源性的决定因子Pax6可以指导体外星形胶质细胞(astrocyte,AST)转分化为具有一定功能的神经元,进一步验证了特定因子的表达可以增强细胞的神经元谱系特性,甚至指导非神经元细胞的神经发生,表明通过调控特定转录因子的表达可改变终末分化细胞的命运,并将其重编程为神经元细胞。随后,许多研究也证实了成纤维细胞、星形胶质细胞或其他细胞能够响应Ascl1的异位表达重编程为诱导神经元(induced neurons,iNs),并且能够在神经网络中发挥功能,促进了相关神经功能的恢复[13]。

2 Ascl1诱导成纤维细胞向神经元的转分化

成纤维细胞起源于胚胎中胚层的间充质,增殖能力强且代谢旺盛,在体内分布广、数量多,并且具有多向分化能力,尤其是分化为成骨和成软骨细胞、去分化为多能干细胞甚至转分化为神经元细胞[14-17]。目前已有多项研究利用Ascl1或多因子组合将成纤维细胞直接重编程为具有功能的诱导神经元。

2.1 Ascl1诱导成纤维细胞向多巴胺能神经元的转分化

2010年,Vierbuchen等[18]筛选了在神经发育中发挥重要作用的转录因子Ascl1、Brn2和Myt1,并以慢病毒为载体过表达于小鼠成纤维细胞中,发现单独表达Ascl1能够在体外诱导成纤维细胞为具有未成熟电生理特性的iNs,而共表达Ascl1、Brn2和Myt1(ABM)三因子时,iNs表现出与内源性成熟神经元相似的膜电生理特性,并且这些iNs大多数为兴奋性神经元。Pfisterer等[19]在ABM三因子组合的基础上共转染指导多巴胺能神经元命运决定转录因子Lmx1a和FoxA2,观察到成纤维细胞在体外诱导为功能性多巴胺能神经元(induced dopaminergic neurons,iDANs),实现将成纤维细胞向特定神经元亚型的成功转化。非人类灵长类狨猴成纤维细胞在Ascl1结合microRNA-9/9*和microRNA-124诱导下也转分化为具有自发神经元活动的神经元[20]。

以上研究仅证明了过表达Ascl1可将体外培养的成纤维细胞重编程为iNs。Caiazzo等[21]将Ascl1、Nurr1和LMX1a因子共表达于小鼠、健康成人及帕金森患者供体来源的成纤维细胞,获得了功能性iDANs,并成功移植到新生小鼠脑室中,对重编程技术在由体外到体内移植的应用进行了研究,观察到iNs能够整合到宿主神经网络中获得完整的神经元多巴胺能细胞命运,并长期保持电生理活动。进一步研究发现,将Ascl1、Ngn2、Sox2、Nurr1和Pitx3多因子转化的iDANs移植到帕金森大鼠疾病模型上后,iDANs能够在体发挥多巴胺能神经元的功能,缓解帕金森大鼠的相关运动症状[22],实现了重编程iDANs由转变形态到发挥功能的应用。这一发现为未来帕金森疾病的治疗提供了一个潜在有效的治疗策略。

2.2 Ascl1诱导成纤维细胞向氨基酸类神经元的转分化

除了多巴胺能神经元外,Ascl1也能将成纤维细胞重编程为氨基酸类神经元。Ascl1与Foxg1、Sox2、Dlx5和Lhx6多因子共同重编程成纤维细胞的功能性γ-氨基丁酸能神经元,能够整合到宿主神经元网络中抑制宿主海马体的兴奋性神经元[23],这一研究为治疗癫痫或平衡其他神经系统疾病相关的神经元回路中抑制/兴奋信号传导提供了新的治疗策略。

此外,Ascl1、Brn2、Myt1三因子(ABM)与其他因子共转染诱导人成纤维细胞为具有电生理特性的前脑谷氨酸能神经元,这些iNs移植到哺乳动物脑室能够与中枢神经系统宿主神经元建立突触连接[24]。另一项研究通过将ABM因子与bHLH家族的NeuroD1在胎儿和人出生后成纤维细胞中共表达,获得的谷氨酸能神经元,能够形成功能性突触整合到体外小鼠皮层神经元共培养神经网络中,但是在体内的研究未能进一步完善深入[25]。在此之前,科学家们应用的重编程策略多为ABM三因子或在ABM因子的条件下添加其他因子诱导成熟神经元的产生,但在没有其他因子辅助的情况下,Chanda等[26]也证实了单因子Ascl1也足以诱导体外培养的成纤维细胞为成熟谷氨酸能神经元。

2.3 Ascl1诱导成纤维细胞向5-羟色氨酸能神经元的转分化

FEV、Lmx1b和FoxA2是5-羟色胺能神经元终末分化的关键转录因子,Xu等[27]将其同Ascl1转染于人成纤维细胞中,发现细胞检测到5-HT、AADC等神经元标志物的表达,表现出自发动作电位和自发兴奋性突触后电流,表明经诱导细胞转分化为5-羟色胺能神经元(Induced serotonergic neurons,iSNs)。这项研究与之前诱导成纤维细胞向神经元的转分化研究一致,即在没有Ascl1表达的条件下,神经元的产生效率明显受到影响。同年,Vadodaria等[28]发现在人成纤维细胞中过表达5-羟色胺能神经元中高表达的转录因子NKX2.2、FEV、GATA2和LMX1B与神经元转录因子Ascl1、NGN2,能高效转化为5-羟色胺能神经元。

除此之外,通过Ascl与其他因子共同作用于成纤维细胞重编程可诱导出视网膜神经节细胞、去甲肾上腺素能神经元等[29-31]。

2.4 Ascl1诱导成纤维细胞向神经元转分化的相关机制

ABM因子重编程成纤维细胞向神经元转分化过程中存在着分级机制,即Ascl1结合成纤维细胞中许多同神经祖细胞相似的神经元靶基因位点,并打开封闭的染色质、快速诱导染色质重塑和核小体定相,在重编程早期具有主导靶向能力,发挥着“先驱转录因子”的作用[32-33]。进一步单细胞测序分析提示,外源性Ascl1的过表达导致成纤维细胞相关基因的沉默和增强子的失活、神经元靶基因的上调以及细胞周期基因的下调,并参与神经元形态学定义基因的表达,从而诱导细胞退出细胞周期,进入神经元发育的起始阶段,与此同时Ascl1重编程细胞过程中伴随不同启动子的高甲基化的发生,如单独诱导非CG甲基化的独特神经元特征,而其他辅助转录因子如Brn2和Myt1等则针对竞争性成肌细胞程序,在从头甲基化中抑制供体成纤维细胞转化过程中的成肌细胞程序,从而指导更准确的神经细胞转化程序,为神经元转分化后期的成熟发育创造了有利条件[34-36]。

3 Ascl1诱导星形胶质细胞向神经元的转分化

星形胶质细胞是成年中枢神经系统中分布最为广泛的细胞,约占中枢神经系统细胞的20%～40%[37]。在成人大脑中,成熟的星形胶质细胞一般处于静止状态,当大脑处于损伤或应激状态下,星形胶质细胞则反应性增生肥大,表达胶质纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein)、巢蛋白(nestin)等神经前体细胞蛋白,此时星形胶质细胞具有多能神经干细胞的潜能[38],是神经元重编程中最理想的细胞来源类型。

3.1 Ascl1诱导星形胶质细胞向神经元的转分化

Berninger等[39]利用Ascl1和Neurogenin2共同诱导出生后早期小鼠大脑皮质星形胶质细胞转化获得iNs,这些iNs存在动作电位,但未建立功能性突触输出,也未确定具体亚型。Liu等[40]证实仅Ascl1的表达足以诱导体外培养的出生后及成年小鼠的中脑背侧星形胶质细胞转分化为功能性神经元;该研究进一步实验表明,使用GFAP启动子的腺相关病毒作为载体感染体内中脑背侧星形胶质细胞表达Ascl1,能够有效将中脑背侧星形胶质细胞转化为功能性GABA能及谷氨酸能神经元。在DLX2协同Ascl1的作用下,体外皮层星形胶质细胞可定向诱导出功能性GABA能神经元并建立功能性突触输出[41],而移植到内侧颞叶癫痫伴海马硬化症模型小鼠海马体中的皮质星形胶质细胞可重新编程以产生GABA能iNs,并与颗粒细胞建立GABA能突触整合到癫痫网络中,以减少自发性复发性海马癫痫发作[42]。

除氨基酸类神经元外,Ascl1同NeuroD1、LMX1A、MiR218体外实验将人星形胶质细胞重编程为多巴胺能神经元,体内实验将帕金森成年小鼠纹状体星形胶质细胞重编程为多巴胺能神经元,并实现对帕金森模型小鼠部分运动障碍症状一定程度上的改善[3,43]。

在Ascl1诱导下,星形胶质细胞可向不同的神经元亚型转分化,这可能是由于星形胶质细胞内Notch1信号通路的水平导致了星形胶质细胞对神经元重编程的敏感性不同[44],而不同的转录因子辅助以及星形胶质细胞起源影响着重编程的方向[45],这对深入研究诱导星形胶质细胞定向重编程为特定亚型神经元提供了新的切入点,为治疗人类神经疾病补充各种神经元亚型的细胞来源提供了新的可能。

3.2 Ascl1介导星形胶质细胞转化为神经元的相关机制

Ascl1在重编程星形胶质细胞向神经元的转化过程中早期诱导了神经源性程序——上调参与神经系统发育和神经发生调节的Insm1、Sox11、Sox4、Dll1等以及下调星形胶质细胞中Aqp4、Slc1a3、Fgfr3和胶质祖细胞中的Pax6、Fabp7、Vimentin等典型基因的表达,提高Rcor2、Ncor2、Cbfa2t3等转录因子的转录活性[46],并结合了多个靶标基因如KLF10、MyT1、MyT1L等进行调控iNs细胞轴突形成及电生理成熟[47]。同时,Ascl1丝氨酸磷酸化受体位点突变增强成人皮质星形胶质细胞的神经元转化[48];神经元富含的线粒体抗氧化蛋白如SOD1和PRDX2,通过对抗异常的活性氧来增加更多的细胞进入神经元转化过程[49];作为抑制因子,NOTCH1信号传导介导Ascl1驱动的星形胶质细胞到神经元的转化[50]。

4 Ascl1诱导Müller胶质细胞向神经元的转分化及机制

Müller胶质细胞具有干细胞潜能,是视网膜再生的可靠来源[51]。Müller胶质细胞中Ascl1或协同Atoh1、Pou4f2,Islet1表达,可转化为视网膜神经元,与宿主视网膜神经元建立突触连接,并对光做出反应,有效刺激视网膜再生[52-53]。

Ascl1在重编程Müller胶质细胞的过程中,可与神经系统发育相关基因如Tubb3、NeuroD4等结合调控神经发生[54],同时受到STAT信号途径的调控影响,STAT信号途径激活或与Ascl1结合诱导分化基因抑制剂(inhibitor of differentiation,Id)表达,从而抑制Ascl1在Müller胶质细胞亚群中启动神经发生;此外,STAT途径的抑制导致Ascl1与非STAT靶标的结合增加,导致神经元基因的富集,实现Ascl1在神经发生所需的基因上更有效的结合,促进重编程的发生[55]。

5 Ascl1诱导其他非神经元细胞向神经元的转分化

在转录因子Ascl1重编程策略下,其他非神经元细胞的研究也取得了一定进展。在成年鼠损伤大脑皮层NG2胶质细胞中过表达Ascl1和Sox2可诱导皮层的功能性iNs发生[56],体内海马原位神经胶质细胞中Ascl1和Dlx2可诱导GABA能iNs,减少内侧颞叶癫痫伴海马硬化症小鼠癫痫发作[36],Ascl1协同其他因子将成年人脑周细胞、多能干细胞成功重编程为功能性iNs[57-59],更有Ascl1对肿瘤细胞进行重编程的成功验证[60-61]。

6 总结和展望

近年来在直接神经元重编程领域取得了长足的进步,尤其是Ascl1相关的重编程方案正日趋成熟。利用Ascl1将非神经元细胞直接重编程为神经元细胞以代替特异性神经元发挥功能,这对于更深入地研究神经系统细胞的同一性和可塑性具有重大价值,同时为治疗人脑神经系统疾病细胞代替治疗、药物发现和再生医学研究开辟了一条全新的道路。体内外的重编程已使得模型动物的神经功能和相应运动症状得到显著改善,但迄今为止仅仅局限于对局部神经元、局部神经网络和相关运动障碍症状的观察。使用重编程的神经元替换退化或损伤的神经元,重编程后的神经元产量如何维持稳定、身份特性是否能维持长期稳定,其新形成的神经网络是否存在异常连接,正常的神经通路是否受损以及如何整合到神经网络中发挥功能仍未得到解答。此外,将非神经元细胞如胶质细胞在体重编程为诱导神经元,其局部非神经元细胞的数量和功能如何维系,也应得到重视。神经系统的重编程更深入的机制仍不十分明朗,这将不利于将细胞重编程技术应用于未来神经系统疾病的治疗中。因此,要将这项前沿技术运用到实际临床中,仍需对神经元细胞直接重编程的细胞网络连接以及重编程中的分子机制和细胞微环境进一步探索。