肉制品中卡那霉素胶体金快速检测试纸条的研制

伍智蔚,董 露,韩佳佳

(1.中国科学院 沈阳应用生态研究所,辽宁 沈阳 110015; 2.沈阳市食品药品检验所,辽宁 沈阳 110122)

0 引言

卡那霉素分为盐酸卡那霉素和硫酸卡那霉素,它是一种蛋白质生物合成抑制剂[1].卡那霉素作为一种氨基糖苷类抗生素,因其价格低廉且抗菌性广的特点,而被人们广泛使用在动物养殖中,但是其使用不规范导致越来越多的动源性食品中残留超标[2].医学研究表明,卡那霉素使用不当会对人体产生严重的毒副作用[3-6].因此,规范卡那霉素的使用,对确保食品安全进而保障人们健康具有重大意义.目前,食品中卡那霉素残留的检测方法以仪器分析法为主,常用的有高效液相色谱法、气相色谱法、液相色谱-质谱法等[7].此外,还有电化学检测法、比色法、荧光法以及酶联免疫分析法等[8-10].上述方法虽然灵敏度高,但操作复杂,价格昂贵,且受仪器数量限制.因此,很有必要研究一种快速、经济、简便的检测方法.

胶体金快速检测试纸条是食品安全检测中常用的一种检测手段[11],具有便携、快速、原地检测等特点,可以大大降低检测成本,提高检测效率.本文研制了一种卡那霉素胶体金检测试纸条,以实现对肉制品进行卡那霉素残留的快速检测.

1 材料与方法

1.1 实验仪器和材料

1.1.1 主要仪器

UV759CRT型紫外-可见分光光度计(青岛聚创华业分析仪器有限公司),BSA224S型分析天平(赛多利斯科学仪器有限公司),TGL-16A型高速台式离心机(常州迈科诺仪器有限公司),AM-5250C型恒温磁力搅拌机(天津奥特赛恩斯仪器有限公司),PHS-3C型pH计(上海仪电科学仪器股份有限公司),DMT-2500X型旋涡振荡器(南京互川电子有限公司),JYEB-60型超纯水机(北京嘉远环保科技有限公司).

1.1.2 材料

氯金酸、蔗糖、柠檬酸三钠、碳酸钾、磷酸盐缓冲液、PEG-20000、Tween-20,上述试剂均为分析纯,购于国药集团试剂有限公司.

超纯水(18.2 MΩ·cm),自制.

PVC底板、硝酸纤维素膜(CN95/CN140)、样品垫、金标垫、吸水纸,购于上海杰一生物技术有限公司.

肉制品(鲜猪肉、腊肉、罐头等),购于生鲜超市.

牛血清白蛋白、抗原、卡那霉素标准品、卡那霉素单克隆抗体、青霉素、氨苄青霉素,购于赛默飞世尔科技公司.

1.2 实验方法

1.2.1 胶体金溶液的制备

采用柠檬酸三钠还原法来配制胶体金溶液.首先在锥形瓶中加入50 mL超纯水和1 mL 1%氯金酸,摇匀后将其放入到恒温磁力搅拌器中加热至沸腾,停止升温,然后迅速加入2.0 mL 1%柠檬酸三钠溶液,继续保温5 min.当看到溶液变红时停止加热,冷却至室温,采用超纯水定容至100 mL,密封保存备用[12].

1.2.2 金标抗体的制备与鉴定

1.2.2.1 金标抗体的制备

首先在离心管中加入1 mL胶体金溶液,用0.1 mol/L的碳酸钾溶液调节pH值至8.3,并加入20 μL卡那霉素抗体溶液(0.2 g/L),混匀,静置15 min.然后加入牛血清蛋白溶液20 μL,密封静置25 min.最后在高速离心机中离心25 min(温度4 ℃,离心力24 200 g),移除上清液,加入胶体金复溶液(采用0.01 mol/L磷酸盐缓冲溶液、0.5% Tween-20、5%蔗糖、0.1%牛血清蛋白和0.1% PEG-20000配伍制备)溶解沉淀物,混匀,4 ℃条件下冷藏待用.

1.2.2.2 胶体金标记抗体的鉴定

首先吸取3 μL的二抗溶液在硝酸纤维素膜上划一条线,待完全干燥后,吸取3 μL的胶体金抗体溶液划在之前的那条线上,自然晾干.然后吸取超纯水划在那条线上,如果线上出现红色的点,那么说明胶体金标记抗体是成功的.

1.2.3 试纸条的组装和检测方法

1.2.3.1 试纸条的组装

如图1所示,按照顺序将硝酸纤维素膜、金标垫、样品垫、吸水纸一次粘贴在相应位置.首先吸取已经确定好浓度的二抗,在硝酸纤维素膜上划一条质控线,吸取已经确定好浓度的抗原,在硝酸纤维素膜上划一条检测线.然后以1%牛血清白蛋白溶液作为封闭液对硝酸纤维素膜进行封闭和干燥.吸取最适喷涂量的金标抗体划到硝酸纤维素膜上,置于室温下干燥.最后使用工具将试纸条进行切割,将切割好的试纸条密封保存于塑料盒内,待用.

图1 试纸条的组装

1.2.3.2 试纸条的测定方法

吸取50 μL的待测样液滴于微孔板中,将试纸条带有样品垫的一端(见图1中的S位置)插入含有待测样液的微孔板中.通过观察可以发现,待测物质通过层析作用与金标垫处的抗体相遇,如果待测物与抗体没有完全结合,那么层析到检测线处(见图1中的T线)就会与抗原结合,从而在检测线处显现红色.未完全结合的金标抗体层析到质控线处(见图1中的C线)与二抗反应,从而在质控线处显现红色.如果待测物与抗体完全结合,那么层析到检测线处就不会有较为清晰的红色,接着层析到质控线处,在质控线处出现较为清晰的红色.

1.2.4 试纸条制备条件优化

1.2.4.1 试纸条材料的选择

首先吸取样品溶液分别划在型号为CN95和 CN140的硝酸纤维膜上,然后将其放入37 ℃的干燥箱中烘干.吸取胶体金标记抗体溶液分别划在之前划线的位置,最后根据线上的颜色的深浅来选择较好型号的硝酸纤维素膜.

1.2.4.2 金标抗体最佳稀释度和喷涂量

用金标垫处理液按照2、4、6倍的稀释倍数分别稀释纯化好的金标抗体.在控制其他条件不变的情况下,分别在硝酸纤维素膜上喷洒喷涂量分别为30 μL/cm2、50 μL/cm2和70 μL/cm2的金标抗体稀释液,通过对比不同稀释度和不同喷涂量的硝酸纤维素膜的变化情况,来选择金标抗体最佳稀释度和喷涂量.

1.2.4.3 硝酸纤维素膜上抗原与二抗最佳浓度

将抗原分别稀释为1.0 g/L、1.5 g/L和1.8 g/L的抗原稀释液,将二抗分别稀释为1.0 g/L、1.2 g/L和1.5 g/L的二抗稀释液.分别吸取上述被稀释后的抗原和二抗溶液10 μL,在硝酸纤维素膜上划一条检测线,分别加入10 μL浓度为0 μg/L、50 μg/L、100 μg/L和150 μg/L的卡那霉素标准液,最后通过硝酸纤维素膜上的检测线的显色情况来选择抗原和二抗的最佳浓度.

1.2.5 试纸条的性能测试

1.2.5.1 试纸条灵敏度检测

分别将卡那霉素标准品浓度为0 μg/L、50 μg/L、100 μg/L、150 μg/L和200 μg/L的溶液各取50 μL置于微孔板中,然后将试纸条带有样品垫的一端插入微孔板中,根据试纸条的变化情况来判断试纸条的灵敏性.

1.2.5.2 试纸条特异性检测

分别将浓度为0 μg/L、50 μg/L、100 μg/L、150 μg/L和200 μg/L的卡那霉素、青霉素、氨苄青霉素溶液置于微孔板中,然后将试纸条带有样品垫的一端插入微孔板中,根据试纸条的变化情况来判断试纸条的特异性.

1.2.5.3 试纸条稳定性检测

将制作好的试纸条分别置于自然暴露环境、4 ℃恒温箱环境和真空环境等三个环境下保存3个月,分别随机抽取各组试纸条(保证取样的随机性与结果的准确性)进行稳定性测试(根据试纸条的灵敏度和特异性的变化来确定试纸条的稳定性).最终通过不同保存时间下试纸条灵敏度和特异性的检测结果来确定试纸条的稳定性.

1.2.6 数据处理

通过SPSS和Origin软件对实验中的数据进行处理与作图,每组实验平行重复三次,记录检测结果.

2 结果与分析

2.1 胶体金溶液的鉴定结果

图2为胶体金溶液的紫外-可见分光光度计扫描图.从图2可知,该胶体金溶液的最大吸收峰波长为520.6 nm.将其代入公式:Y(颗粒粒径)=0.427 1X(λmax)-211.60,计算得出胶体金颗粒粒径为10.74 nm,符合胶体金粒径应用标准[12].

图2 胶体金溶液紫外可见分光光谱扫描图

2.2 试纸条的制备条件优化结果

2.2.1 材料优化结果

实验结果如图3所示.CN95的质控线比CN140的质控线颜色更深、更明显,所以选择CN95硝酸纤素膜.

图3 不同硝酸纤维素膜的显色

2.2.2 金标抗体稀释度和喷涂量优化结果

不同稀释度和不同喷涂量的测试结果见表1.根据表1中结果,最佳稀释度为2倍,最佳喷涂量为50 μL/cm2.

表1 金标抗体不同稀释度和喷涂量的显色情况

2.2.3 抗原与二抗的浓度优化结果

表2为不同浓度的抗原和二抗的显色情况.根据表2中的实验数据和硝酸纤维素膜上的显色情况,最终选择抗原浓度为1.5 g/L,二抗浓度为1.2 g/L.

表2 不同浓度的抗原和二抗的显色情况

2.3 试纸条的性能测试结果

2.3.1 试纸条灵敏度

灵敏度实验结果如图4所示.由图4可知,试纸条的最低检出限为100 μg/L.该检出限满足猪肉制品国家标准规定的卡那霉素检出限(100 μg/L).

注: 由右至左卡那霉素标准品浓度分别为0、50、100、150和200 μg/L.图4 试纸条检出限测定结果

2.3.2 试纸条特异性

特异性检测结果如表3所示.通过测试不同浓度的卡那霉素、青霉素、氨苄青霉素等物质的显色情况,发现试纸条对卡那霉素具有明显的特异性.

表3 特异性检测结果

2.3.3 试纸条稳定性

试纸条分别在自然暴露环境、4 ℃恒温箱环境和真空环境下保存3个月后的特异性检测结果如表4所示,灵敏度结果如图5所示.通过试纸条灵敏度和特异性的检测结果可知,试纸条的稳定性好.

表4 不同环境中特异性检测结果

图5 不同环境中灵敏度测定结果

2.3.4 实际样品测定

采用本文建立的试纸条法,对购于生鲜超市的鲜猪肉、腊肉、罐头制品各10份进行抽样检测.结果表明,卡那霉素在样品中均未检出,符合国家标准规定的检出限(100 μg/L)[13].

3 结论

建立了一种快速、简便的针对肉制品卡那霉素残留的检测方法.

根据上述最佳条件制作出的试纸条检测肉制品卡那霉素残留的最低检测限为100 μg/L,该检出限满足猪肉制品国家标准规定的卡那霉素检出限.该检测方法能够用于肉制品的卡那霉素残留的快速检测,而且经济、简便,具有实用价值.