酶固定化技术的最新研究进展

潘 虹,陆天炆,王晓军,洪一楠

(西安工程大学 环境与化学工程学院,陕西 西安 710048)

0 引 言

生物酶是一类具有催化效率高、专一性强的生物催化剂[1],其本质是一种蛋白质。因此,生物酶通常需在常温常压等温和条件下才能表现出其高催化性能,当离开特定环境就会出现酶活性和稳定性迅速降低的缺点[2]。活性炭可以吸附蔗糖酶进行蔗糖水解,且保持了蔗糖酶较好的催化活性[3]。由此,固定化酶的思想被首次提出。随后,研究人员开始通过一系列酶固定化技术来改善游离酶存在的缺点。

酶固定化技术就是指将游离酶通过一定的技术手段固定在某些不溶性载体上,进而使其在敏感环境下仍然表现出较高的稳定性和酶活性[4]。经固定化后的酶,可以借助载体的保护作用或者与载体之间相互作用,保护了酶蛋白的空间构象[5],进而提高了对pH、温度、重金属离子等影响因素的耐受性。同时,固定化酶可以通过简单的离心过滤等手段从反应体系中分离出来,促进漆酶的回收和重复使用[6]。

目前,固定化酶技术已经在食品加工[7]、生物传感器[8]、纺织印染废水处理[9-10]、生物漂白[11]等诸多领域得到广泛的应用,其固定化技术也表现出愈发成熟的发展。本文综述了近五年酶固定化技术的发展,重点表现在固定化方法和固定化载体上,以及酶固定化技术在多个领域的应用。

1 酶固定化方法

酶固定化方法可分为传统固定化方法和新型固定化方法。表1列出来近五年的一些酶固定化技术所用的方法。

表 1 固定化酶所用固定化方法

1.1 传统固定化方法

1.1.1 吸附法

吸附法即物理吸附,物理吸附是一种简单易行的方法,通过氢键、疏水作用和范德华力等相互作用使酶吸附到不溶于水的载体表面,该方法操作步骤简洁且不需要额外添加化学试剂,但其固定效果较差且容易受外界条件影响[29]。WANG等采用吸附法将漆酶固定在碱改性生物炭(A-MB)上实现对孔雀石绿(MG)的吸附降解,结果表明,A-MB对MG表现出最大吸附量757.58 mg/g,固定化漆酶A/lac@A-MB对MG的去除率可达97.70%,10次循环后仍然表现出超过75%的去除率[12]。ACET等以沸石颗粒(PPA)为原料,通过简单方法制备了Cu2+-APPaC包埋型复合晶凝胶(Cu2+-APPaC)用于α-淀粉酶吸附固定,结果表明,α-淀粉酶最大吸附量可达858.7 mg/g,同时相较于游离酶,其操作稳定性和存储稳定性也表现出明显的优势[13]。

1.1.2 结合法

结合法是利用酶的侧链基团与载体表面的基团发生反应形成共价键,利用共价键将酶固定在载体上[30]。GHASEMI等将MIL-53(Fe)通过表面官能化对2种脂肪酶进行共价固定,结果显示脂肪酶固定化体系虽然没有实现对酶的高负载,但仍然表现出更广泛的温度和pH值稳定性,同时实现了酶的可重复使用能力和稳定性的显著改善[14]。此外,共价结合法由于化学键的形成,容易使酶的蛋白质构象发生改变,从而降低酶活性[31]。FAN等采用戊二醛多点共价结合法和吸附-交联法,以球形二氧化硅为载体,固定化皱纹假丝酵母脂肪酶(CRL),结果表明,多点共价处理后脂肪酶二级结构发生变化,使酶的残余活力下降[15]。但相比之下,共价结合法制备的酶体系具有更好的重复使用性和稳定性,使其在酸化油脂催化水解中更有潜力。

1.1.3 化学交联法

交联法是通过一些双功能试剂将酶和载体进行连接[31],主要用到的交联剂有戊二醛、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺(EDC)、二醛淀粉和二醛纤维素[30,32-33]等。CHEN等以戊二醛作为交联剂制备了一种具有超顺磁性的固定化漆酶Fe3O4@SiO2-NH2-Lac,该固定化体系表现出了良好的稳定性,对有机溶剂、金属离子有显著的耐受性和良好的循环使用性,同时在对酚类化合物的去除降解方面也表现出巨大的潜力[16]。QIU等以二醛淀粉为交联剂,采用共价固定法将漆酶在离子液体改性的磁性纳米载体上进行固定,较于其他固定化漆酶,在处理含酚废水中表现出更大优势[17]。然而常见的交联剂在固定化过程往往会表现出一定的负面影响[34],为此研究人员着手发掘绿色安全的新型交联剂来避免这种负面影响。例如,OUYANG等提出了一种新的绿色高效固定化酶的方法——京尼平苷酶解物作为交联剂固定化漆酶[18]。与直接使用京尼平或戊二醛作为交联剂,该方法绿色、安全,可应用于需要严格控制毒性的食品和医药行业。DANIELLI等研究了一种双功能交联剂2,5-二甲酰基呋喃 (DFF) 将葡糖淀粉酶固定在氨基官能化甲基丙烯酸树脂上[19]。使用海洋细菌费氏弧菌进行了生态毒性测定,相比于戊二醛,DFF表现出更低的生物毒性。

1.1.4 包埋法

包埋法是将酶固定在聚合物材料的网格结构或微囊结构等多空隙载体中[35]。这种方法可以提供更好的保护和稳定性,限制了酶的扩散。但同时也存在孔隙的扩散阻碍,使得该方法的循环使用效率下降。例如,LATIF等采用包埋法将漆酶固定化在海藻酸铜微球上进行双酚A的降解[20]。相比于游离酶,固定化漆酶表现出更高的pH、温度稳定性及储存稳定性,但在循环使用5次后剩余酶活降到了21.5%。

1.2新型固定化方法

1.2.1 传统固定化方法的改进

传统的单一固定化方法进行酶固定往往存在各自的缺点,因此出现了将单一方法进行两两结合来固定化酶的改进方法。常见的包括吸附-交联法[21-22]、吸附-包埋法[23-24]、交联-包埋法[25]等。例如,FATHALI等以介孔二氧化硅为载体,采用交联-包埋相结合的固定化方法制备了包埋交联漆酶聚集体(E-CLEA)[25]。相对于游离漆酶,条件优化后的固定化漆酶显示出较好的热稳定性和pH稳定性。此外E-CLEA存储21 d仍然具有较高的相对活性,在重复使用20次后,其活性保持率可达初始活性的79%。对污染废水中苯酚的去除率可达73%[25]。

1.2.2 共固定化酶法

共固定化酶是指将多种酶同时固定化在同一载体上的一种方法。ARANA-PEA等实现了将5种酶进行逐层固定化的策略,使得整个固定化酶体系的活性明显增强[26]。与单一酶的固定化相比,共固定化酶法通常具有更大的优势。在保证了固定化后酶稳定性提高的同时,不同酶在共固定后,由于处于同一载体上,酶之间可以发挥协同作用,且反应底物可以连续在酶之间传递,从而简化了反应步骤。GAO等制备了一种化学酶级联反应体系(GA&GOx@Au-SiO2),实现葡萄糖淀粉酶(GA)和葡萄糖氧化酶(GOx)共固定化[27]。借助于双酶和载体之间的级联效应,实现了从可溶性淀粉中高效提取葡萄糖酸。在保证了固定化双酶稳定性的同时,Au的加入可以使中间产物H2O2快速脱除,显著提高固定化体系的重复利用率。类似地,LIU等制备了一种具有可逆热响应释放的双酶固定化体系共固定GOx和辣根过氧化物酶(HRP),在葡萄糖浓度检测过程中表现出优于单酶检测试剂盒的良好性能[28]。

此外,有学者研究发现,对于如漆酶这种绿色催化剂,较低的氧化还原电位大大限制了其在各个领域中的应用。但发现在固定化体系中引入具有高氧化还原电位的介体可以弥补漆酶的这一不足[36]。LOU等基于MOFs膜实现了漆酶和介体ABTS的共固定化,结果显示,固定化漆酶的底物亲和力要高于游离漆酶[37]。

2 酶固定化载体

用于酶固定化的载体主要包括天然载体、人工合成载体和纳米载体,见表2。在选择固定化载体时要充分考虑具体的应用领域和需求等。

表 2 固定化酶所用载体材料

2.1 天然载体材料

天然载体最大的优点就是来源广泛、低成本和低生物毒性。常用的天然载体有纤维素[38]、琼脂糖[39]、壳聚糖[40]和藻酸盐[41-42]等。同时,将天然载体杂化后用于酶固定化可以表现出更优良的固定化能力。MEHANDIA[43]等利用天然载体制备了壳聚糖-黏土复合微球(CCB-L),采用包埋法对漆酶和介体进行共固定。微球在洗涤和储存期间均未观察到酶泄漏。同时固定化漆酶-介体体系通过填充床反应器系统(PBRS),对纺织废水的脱色率可达78%,COD、BOD以及毒性水平均下降。类似地,BAI等将海藻酸钠和壳聚糖交联形成复合凝胶球,采用包埋法固定中性蛋白酶[44]。固定化酶在较宽的pH(5～8)和温度(30～80 ℃)范围表现出高于游离酶的相对活性,循环使用性和存储稳定性也保持在良好水平。

2.2 人工合成载体材料

2.2.1 无机材料

无机材料来源广泛、合成简单、机械强度高,可以直接用于酶的固定。常见的无机材料有二氧化硅[45]、二氧化钛[48]、硅酸盐[49-50]和氧化铝[51]等。为了提高固定化效率,常常会先对无机材料进行表面改性再用于固定化。ZHAI等使用聚乙烯亚胺(PEI)和多巴胺的共沉积对二氧化硅微球进行改性,用于CO2酶促转化甲酸盐。优化后PDA/PEI-SiO2载体使得甲酸盐合成的初始反应速率从13.4倍增加至27.2倍。再通过固定化碳酸酐酶(CA)后,甲酸盐的合成速率增加到48.6倍[46]。随后,LIU等同样对SiO2微球进行PEI的表面改性后用来固定化甲酸脱氢酶,同样实现了CO2酶促转化甲酸盐的高效合成[47]。

2.2.2 高分子材料

人工合成的高分子材料具有良好的结构刚性和其他优良的力学性能。如聚酰胺、聚乙烯醇等具有良好的固定化能力。ZHAO等采用3种胺类试剂将聚酰胺-胺树枝状大分子(PAMAM)接枝到Fe3O4纳米粒子上,利用戊二醛作为交联剂得到了不同代数的Fe3O4@SiO2/PAMAM磁性纳米载体[52]。固定化酶表现出相对游离酶更高的活性,而且改善了其在更宽的pH和温度范围内的耐受性。ALAGÖZ等先用聚乙烯醇水凝胶包裹烯还原酶(ER),再固定到氨基官能化的硅胶上。包埋后的ER比游离ER的热稳定性高34.4倍。在重复使用10次后,固定后的 ER仍保持其初始活性的85%[53]。

2.2.3 复合材料

针对有机、无机材料在实际应用中存在的不足,不少文献报道了将2类材料通过物理或化学手段进行复合得到新型复合材料,可以得到性能更优的固定化载体。例如,GIRELLI等将二氧化硅和壳聚糖杂化得到复合材料,相比单材料拥有更好的机械强度、热稳定性及生物相容性。存储30 d后仍具有大于70%的相对活性。对漆酶进行固定化后,固定化率达到92%,在较宽的温度和pH范围内固定化后漆酶表现出的稳定性也要高于游离漆酶,重复循环利用15次剩余活性仍在61%以上[54]。

2.3 纳米材料载体

纳米材料凭借其小尺寸、高表面积和易改性等特点,成为了酶固定化载体研究的焦点。各种改性后的纳米材料也在酶固定化领域得到蓬勃发展。

2.3.1 磁性纳米载体

磁性纳米载体是一种可以通过外部磁场实现固定化酶快速分离的良好材料。凭借这种磁学性质和低生物毒性[16],其在固定化载体的选择上表现突出。Fe3O4是被广泛使用的一种磁性材料。但由于纯Fe3O4自身的表面惰性和高团聚,往往需要对其进行表面改性后再应用于固定化。RAN等制备了一种壳核结构的磁性纳米载体Fe3O4@MoS2@PEI用于漆酶固定。在二硫化钼(MoS2)和聚乙烯亚胺(PEI)的修饰下,磁性载体拥有较大的比表面积并减弱了自身团聚效应,对漆酶的负载量可达120 mg/g,酶活回收率可达90%,同时对于水中持久性致癌有机污染物也表现出了良好的降解效率[55]。

2.3.2 介孔纳米载体

介孔材料作为一种多孔材料,凭借多孔结构和大的比表面积,也是酶固定化的理想载体。金属有机框架(MOFs)[56]凭借着可调控的孔径和较大的比表面积在酶固定化方面得到广泛应用。LI等采用水热法合成氨基官能化的MOF材料制备固定化漆酶,在最优条件下实现了95%的刚果红去除率,6次循环后降解率仍达到84.63%[56]。LU等以酵母为生物模板,将ZIF-8自组装到酵母上得到杂合Y@ZIF-8,再用交联剂固定过氧化物酶得到Y@ZIF-8@t-CAT。固定化酶的温度、pH耐受性得到提高,更值得一提的是固定化酶在存储45 d后活性仍保持在99%以上[57]。

除此以外,TANG等还制备了具有中空结构的共价有机骨架微球(H-COF-OMe)[58]。这种孔缺陷的中空结构有助于加快反应物的扩散,从而改善催化反应过程,对四环素具有优秀的降解效果。

2.3.3 金属纳米载体

金属纳米材料由于引入了金属离子,可以提高载体的理化性质,在酶固定化过程中表现出重要作用。FU等将Fe3+/Fe2+固定到纳米花形的共价有机框架(COF)中实现了固定化酶的磁分离[59]。LI等研究了以磁性Fe3O4为核,将单宁酸(TA)与不同类型金属离子(Cu、Fe、Zn、Mn、Au)配位获得了用于固定化的金属酚醛网络(MPN)涂层[60]。不同金属离子的不同极化能力对MPN涂层的亲水性和疏水性造成影响,从而给酶的固定化效率、催化活性和稳定性带来影响。对于漆酶而言,引入Cu2+对漆酶的活性中心具有正向的促进作用,可以大大提高固定化漆酶的催化活性和底物亲和力[61]。

3 结论与展望

生物酶作为一种极具潜力的生物催化剂,通过固定化技术使其在污染物的降解、食品加工、生物传感器等诸多领域得到了广泛应用。酶固定化技术促使酶在较宽的pH值和温度范围下表现出更优良的催化活性,大大提高了生物酶在敏感环境下的稳定性,实现了生物酶的可分离性及循环使用性。但目前看来,酶固定化技术依然存在一些不足。

1) 酶在固定化后,由于载体的存在使得底物扩散受阻,无法与酶充分接触,导致酶活性降低。可以通过基因工程技术从酶本身出发,利用定点突变或基因重组改变酶结构来提高酶活。同时,通过掺杂合适的单一过渡金属离子或多金属离子协同作用激发酶活也值得深入研究。

2) 目前固定化酶技术在污染物降解等领域的实际应用已经颇为成熟,但对于更深层次的作用机制还停留在较为浅薄的层面。在未来,随着生物信息技术的不断发展,将固定化酶技术与计算机模拟技术交叉,利用计算机软件模拟分析更深层次的机制原理,可以更好地掌握酶固定化技术。

3) 酶固定化技术仍处在实验室研究阶段,在实现更大规模的工业化应用仍然存在较大的挑战。同时,考虑到有些固定化载体制备的时间成本和资金成本,载体若仅用于一次固定化后就无法回收再利用就会造成过度浪费。如何实现固定化酶失活后固定化载体与酶的高效分离,从而实现载体的循环使用是一个新的挑战。因此,酶固定化技术仍然处在不断发展进步的阶段,需要更多的科研者来完善研究。