嗜黏蛋白阿克曼菌对鲤糖代谢的调控机制

王亚娓， 黄真屹， 杨博雅， 游 富， 张新党,2，杨国坤,2， 常绪路,2， 冯世坤,2， 孟晓林,2*

(1. 河南师范大学水产学院，河南 新乡 453007；2. 河南省水产动物养殖工程技术研究中心，河南 新乡 453007)

近年来，随着水产品的需求量不断增加，优质蛋白资源短缺已成为限制水产养殖快速发展的因素[1]。因此，寻找新型蛋白源或使用低廉的非蛋白质能量物质是目前水产养殖行业的焦点之一[2]。糖类作为三大能源物质之一，价格低廉、来源广泛，研究表明，在饲料中添加糖类不仅可以满足机体的能量需求，还能够发挥“蛋白质节约”效应[3]。有关糖类在水产饲料中的应用早在20世纪40—50年代就有迹可循，研究发现，糖类在鱼体内作为能源物质能够促进机体生长发育，提高鱼类的生长效率和蛋白质效率[4]。除此之外，在饲料中添加适宜水平的糖类一方面能够改善饲料的物理性状，降低饲料成本，另一方面可以进行生物氧化产生ATP，有利于机体活化氨基酸，减轻氮排泄造成的养殖水体污染。然而，与哺乳动物相比，鱼类对糖类的耐受能力较低，被认为是天然的“糖尿病患者”[5]，饲料中添加的糖水平过高会导致鱼类发生应激反应，降低饲料利用率，葡萄糖-6-磷酸酶(G6Pase)活性下降，血糖水平持续偏高，且高糖还会导致肝脏肿大、糖原累积，影响鱼类正常肝功能[6]。此外，高糖饲料还会改变鱼类肠道内微生物的菌群组成与结构，造成肠道菌群失调，从而导致鱼类代谢紊乱[7]，有研究分别用含0%、10%、20%、30%和40%糊精的饲料饲喂鲤(Cyprinus carpio)、真鲷 (Pagrus major)、鰤(Seriola) 30 d，发现当糊精水平达到40%时鲤的生长才受到影响[8]。

研究表明，肠道菌群可通过多种作用机制调控鱼类糖代谢，包括调节胆汁酸代谢[9]、产生肠源性短链脂肪酸(SCFAs)[10]、促进脂多糖(LPS)或肽聚糖的产生[11]等。嗜黏蛋白阿克曼菌(Akkermansia muciniphila，Akk)作为二代益生菌，于2004年首次从人体粪便中分离出来，研究发现，Akk能够促进机体肠道屏障完整性[12]、调节免疫反应[13]、抑制肠道炎症[14]、减轻肥胖以及防治胰岛素抵抗、总胆固醇升高和脂肪组织储存[15]等代谢性疾病。此外，相对于正常群体，处于糖尿病前期的病人或Ⅰ型糖尿病小鼠(Mus musculus)体内Akk丰度显著降低，表明Akk与糖尿病之间存在联系[16-17]。在哺乳动物中，Akk代谢产生乙酸、丙酸等短链脂肪酸，与G蛋白偶联受体(GPCR)结合后促进肠道L细胞分泌GLP-1调控机体糖代谢[18]。人体实验探究Akk作为补充剂的安全性及相关参数(即胰岛素抵抗、循环脂质、内脏肥胖和体重)，证实Akk的安全性及耐受性[19]。由于Akk是严格厌氧菌，限制了其在水产中的应用，巴氏灭活的Akk是安全使用的有效方式之一，研究发现，Akk产生的有益效果不会随着巴氏灭活而减少，即巴氏灭活的Akk同样能够降低胰岛素抵抗，改善血脂异常，且效果相对于活菌更加显著[20]。综上所述，目前关于Akk作用的研究多聚焦在血糖平衡、脂肪堆积、肠道通透性和体重等方面，且大多局限于人类及哺乳动物，有关Akk在鱼类糖代谢调控中的具体作用机制目前尚不清楚。

因此，本实验以鲤为研究对象，探究Akk及GLP-1对饲料中不同糖水平的时空响应及其反馈调节，阐明P-Akk介导GLP-1调控鲤葡萄糖代谢的分子作用机制。研究结果有助于进一步认识肠道益生菌Akk在鲤糖代谢调控过程中的作用，从肠道菌群-内分泌激素轴的角度完善杂食性鱼类糖代谢的内分泌调控网络，为Akk应用于饲料添加剂奠定研究基础。

1 材料与方法

1.1 实验饲料及养殖管理

不同葡萄糖水平实验(实验1) 以酪蛋白和明胶作为蛋白源，鱼油和豆油作为脂肪源，分别添加20%、30%、40%、50%的葡萄糖，共配制4种饲料，饲料配方见表1。

表1 实验饲料组成及营养水平(干物质%)Tab. 1 Composition and nutrient levels of experimental diets ( dry matter %)

配制饲料前，所有原料必需经过粉碎机粉碎，且全部过60目筛。将所有粉碎好的饲料原料按配方混匀后加入鱼油和豆油，手工将油脂微粒搓散、混匀，最后再加入适宜蒸馏水使粉状饲料成团，用饲料颗粒机制成粒径2.5 mm的颗粒饲料，晾干后置于−20 °C冰箱保存备用。

实验鲤购买自延津县渔场(新乡，河南)。实验开始前禁食24 h，选择初始体重为(10.5±1.0) g、体格健壮的鲤幼苗360尾，随机分为4组∶C组(20%葡萄糖)、L组(30%葡萄糖)、M组(40%葡萄糖)、H组(50%葡萄糖)，每组3个养殖桶，每桶30尾，养殖实验在河南师范大学水产养殖基地进行，养殖期间每3天换水量为总体积的1/3，光照∶黑暗=1∶1，水温维持在(25±1) °C，pH为6.5～7.8，每日3次定时、定量(体重的3%)投喂。

在养殖4周(4W)、8周(8W)时分别进行取样，取血清、肠道和肠道内容物置于离心管中，－80 °C冰箱保存。本研究获得了河南师范大学实验动物管理和使用伦理委员会批准，实验过程中操作人员严格遵守伦理规范，并按照河南师范大学伦理委员会制定的规章制度执行。

添加P-Akk实验(实验2) Akk的培养。嗜黏蛋白阿克曼菌购自德国微生物菌种保藏中心(DSMZ)DSM 22959。首先配制BHI黏蛋白培养基，用99.999%的氮气除氧，121 °C灭菌30 min，放入厌氧箱中冷却备用，将Akk接种在厌氧培养基中，环境温度为37 °C，厌氧培养36 h，通过稀释涂布平板法计算活菌数，以OD值为横坐标，以平板计数浓度为纵坐标建立标曲。P-Akk∶Akk在70 °C灭菌30 min。

根据实验1的结果，将葡萄糖添加水平为40%组作为基础饲料，选择大小为(16.78±0.39) g、体格健壮的黄河鲤240尾，随机分为NC组(40%葡萄糖)、LP组(40%葡萄糖+108CFU/g P-Akk)、MP组(40%葡萄糖+109CFU/g P-Akk)、HP组(40%葡萄糖+1010CFU/g P-Akk)组，每组3个重复，每桶20尾，养殖4周。接种Akk，测OD值，计算每天添加到饲料中3个浓度P-Akk所需的量，每次投喂前1 h，对P-Akk进行离心，无菌磷酸盐缓冲溶液(PBS)重悬后喷洒至基础饲料上，晾干后进行饲喂，养殖实验管理同实验1。

1.2 样品采集

不同葡萄糖水平实验开展4 W时，每桶随机选4尾鲤，每组总共12尾鲤用MS-222麻醉，测定其体长、体高、体宽和终末重量，其后尾静脉取血置于2 mL离心管中，室温静置4 h后7500×g离心10 min，将血清分装后于−20 °C保藏备用。解剖分离内脏团，取出肠道用PBS冲洗干净，剪取1 cm左右前肠分别放入4%多聚甲醛和2.5%戊二醛中，另取肠道内容物、肝脏和肠道(前肠、中肠)置于离心管中，−80 °C保存；剩余的鱼继续养殖，第8 W时按照上述操作取样。添加PAkk实验开展4 W取样操作亦同上。

1.3 生长指标测定

在养殖8 W后，每组选取12尾鲤测量体重、体长、内脏团及肝脏的重量，以此计算如下生长指标∶

存活率(SR，%)=(终末鱼数/初始鱼数)×100%；

增重率(WGR，%)=(末重−初重)/初重×100%；

特定生长率(SGR，%)=Ln(末重/初重)/天×100%；

饲料系数(FCR，%)=总饲料消耗量/(终末总重−初始总重)×100%；

肝体比(HIS，%)=(肝脏重/全鱼重)×100%；

脏体比(VSI，%)=(内脏重/全鱼重)×100%；

肥满度(CF，g/cm3)=(体重/体长3)×100。

1.4 肠道组织形态分析

将肠道组织进行脱水、透明之后用自动包埋机进行包埋，使用切片机进行切片，厚度为7 μm。按照试剂盒说明书染色，封片后使用光学显微镜观察肠道绒毛高度及肌层厚度。

将肠道组织从戊二醛溶液中取出，使用乙醇溶液进行梯度脱水，加入叔丁醇没过组织，4 °C放置至叔丁醇凝固，真空干燥，喷金处理后在扫描电子显微镜下进行观察、拍照。

1.5 GLP-1含量测定

将GLP-1a、GLP-1b蛋白用CBS梯度稀释后4 °C过夜，加入封闭液37 °C孵育2 h；PBST清洗5次，拍干后分别加入GLP-1a、GLP-1b抗体稀释液，37 °C放置2 h；PBST清洗后拍干，加入抗体稀释液于37 °C放置1 h；用PBST清洗5次后拍干，TMB显色后37 °C放置30 min，2 mol/L H2SO4终止显色，酶标仪OD450读数，绘制标准曲线。将血清或者肠道蛋白用CBS进行稀释，其余操作同上。

1.6 糖代谢相关基因的检测

将收集好的样品加入TRIzol后进行破碎，并按照试剂盒说明书提取肝脏、肠道组织RNA，提取的RNA调节好浓度后按照反转录试剂盒说明书合成cDNA，以cDNA作为模板，18SrRNA基因作为内参进行实时荧光定量PCR。所用引物如表2所示，用公式2−△△CT计算基因的mRNA相对表达水平。

表2 实时荧光定量PCR引物Tab. 2 Real-time PCR primers

1.7 肠道内容物短链脂肪酸及Akk丰度检测

短链脂肪酸(SCFAs)的检测 称取肠道内容物置于离心管中，加入饱和氯化钠溶液混合均匀，酸化后用涡旋仪处理使样品充分溶解，加入乙醚振荡30 s，4 °C、12000 r/min离心10 min，取上清液，加入无水硫酸钠，振荡30 s后4 °C、4500 r/min离心3 min，用0.22 μm滤膜过滤后将样品加入到进样瓶中，使用气相色谱仪检测肠道内容物中短链脂肪酸含量。

Akk定量分析 Akk厌氧培养36 h后使用稀释涂布平板法计算活菌数。根据已有研究[21]确定Akk引物序列如表3，并验证其具有特异性。通过构建含Akk 16SrRNA部分片段的重组质粒，确定Akk实时荧光定量PCR标准曲线。按照QIAamp Fast DNA Stool Mini Kit (QIAamp，德国)说明书提取鲤肠道内容物DNA，检测DNA浓度后－80 °C冰箱保存。根据预实验确定每孔100 ng DNA的加样量，按照反应体系和条件进行荧光定量PCR，根据标准曲线确定Akk丰度。

表3 不同糖水平饲喂对鲤生长指标的影响Tab. 3 Effects of different sugar levels on C. carpio growth indexes

1.8 原代肝脏、肠细胞孵育实验

将鲤麻醉后用75%乙醇擦拭鱼体表面，冰上解剖后取出肝脏、肠道组织放入预冷的含有HBSS的50 mL离心管中，在超净台中将组织转移至无菌培养皿，挑出血块及结缔组织并将其剪碎后反复冲洗3～4次。向30 mL HBSS中加入60 μL EDTA(0.5 mol/L)，轻摇2～3 min至肝脏组织蓬松。弃去上清液，使用HBSS清洗肝脏碎片，每次3 min，共3次。向30 mL HBSS中加入150 ng胶原酶Ⅳ和400 U Dnase Ⅱ(肠道组织用胶原酶Ⅰ、Ⅳ处理)，密封后于28 °C水浴锅中均匀摇晃25 min。消化完毕后，用巴氏吸管反复吹打组织30～40次，使用细胞筛(200目)过滤后转移至50 mL离心管中，离心后弃去上层HBSS。加入预冷的DMEM培养基，密封后离心。弃去上层液体，用DMEM培养基(含10% FBS)重悬细胞，取等量台盼蓝及细胞悬液进行混合，于倒置显微镜下计算细胞数量，每孔细胞培养板接种约105个细胞，28 °C生化培养箱过夜培养。第2天将培养基更换为无血清的DMEM培养基，1 h后进行后续处理。

使用不同浓度的P-Akk (0、108、109、1010个/mL，分别记为P0、P8、P9、P10)孵育原代细胞(n=6)。1、3 h和6 h后吸弃培养基，更换为TRIzol或RIPA以便收集细胞裂解液，−80 °C冰箱保存直至提取RNA，方法同“糖代谢相关基因的检测”。

1.9 数据处理与分析

本实验中所有数据均使用PASW Statistics 18.0软件进行，组间差异的计算采用单因素方差分析(ANOVA)。相关基因的表达用2−△△CT方法计算。使用GraphPad Prism 8.0.2(GraphPad Software Inc., 美国)作图，所有数据均以平均值±标准误差(Mean±SEM)表示，P＜ 0.05被认为具有统计学意义。

2 结果

2.1 不同糖水平对鲤生长性能的影响

不同葡萄糖水平饲喂8周后鲤的末重相对于C组均显著升高，但各组间增重率、特定生长率及饲料转化率无显著性差异(P＞ 0.05)。与C组相比，L组、M组的肥满度显著升高，H组有升高的趋势，但未达到显著水平(P＞ 0.05)。高糖饲喂后鲤的肝体比、脏体比相对于C组有所增加，但仅在M组中达到显著水平(P＜ 0.05)(表3)。

2.2 饲料中不同葡萄糖水平对GLP-1含量、Akk丰度的影响

与20%葡萄糖添加组相比，高糖饲料显著降低鲤血清中GLP-1b含量，GLP-1a无显著性变化(P＞ 0.05)。4W时，高糖饲料显著降低鲤肠道中GLP-1a含量，GLP-1b在L组、M组显著降低(P＜ 0.05)。8W时，L组中GLP-1a的含量显著降低，GLP-1b在各组间无显著性差异(P＞ 0.05)(图1)。

图1 不同糖水平对鲤血清(a) (b)和肠道(c) (d)GLP-1含量的影响C. 20% 葡萄糖组，L. 30% 葡萄糖组，M. 40% 葡萄糖组，H. 50% 葡萄糖组，下同。Fig. 1 Effects of different glucose levels on GLP-1 content in serum (a) (b) and intestine( c) (d) of C. carpioC. 20% glucose group, L. 30% glucose, M. 40% glucose, H. 50% glucose, the same below.

随着葡萄糖添加水平升高，4 W时肠道内容物中Akk丰度逐渐降低，并在M组及H组达到显著水平，但8 W后各组之间已无显著性差异(P＞ 0.05)(图2)。

图2 不同糖水平对鲤肠道内容物中Akk丰度的影响Fig. 2 Effects of different glucose levels on the abundance of Akk in intestinal contents of C. carpio

2.3 P-Akk对鲤血清生化指标及肠道组织形态的影响

添加P-Akk后检测鲤血清中葡萄糖、TG、ALT及AST含量，结果显示，相较于对照组，添加P-Akk后血清中葡萄糖浓度显著降低(P＜ 0.05)，TG含量在LP组、MP组显著降低(P＜ 0.05)，ALT、AST相较于NC组无显著性差异(P＞ 0.05)(图3)。

图3 不同浓度P-Akk对鲤血清生化指标的影响NC. 40%葡萄糖，LP. 40%葡萄糖+108 CFU/g P-Akk，MP. 40%葡萄糖+109 CFU/g P-Akk，HP. 40%葡萄糖+1010 CFU/g P-Akk，下同。Fig. 3 Effects of different P-Akk levels on serum biochemical indexes of Cyprinus carpioNC. 40% glucose, LP. 40% glucose + 108 CFU/g P-Akk, MP. 40% glucose + 109 CFU/g P-Akk, HP. 40% glucose + 1010 CFU/g P-Akk, the same below.

肠道组织扫描电镜及AB-PAS染色结果显示，绒毛上黏蛋白被染成紫色。NC组肠绒毛破裂，微绒毛稀释，肠道损伤严重，添加P-Akk恢复高糖饲料诱导的肠道损伤，且MP组肠绒毛较为完整，破裂情况明显减少，肠绒毛上黏蛋白大量增多；此外，LP组和HP组绒毛高度显著高于NC组，MP组和HP组肌层厚度显著变厚(P＜ 0.05)(图4)。

图4 不同浓度P-Akk对鲤前肠组织形态的影响(a) 1～4. 扫描电镜观察，5～8. AB-PAS染色；SH. 实验损伤，V. 肠绒毛，M. 肌层。Fig. 4 Effects of different P-Akk levels on the intestine morphology of C. carpio(a) 1-4. scanning electron microscope observation; 5-8. AB-PAS staining; SH. experimental damage, V. villus, M. muscularis.

2.4 P-Akk对鲤GLP-1及糖代谢相关基因表达量的影响

饲喂P-Akk后相较于对照组，鲤血清中GLP-1a无显著性变化，GLP-1b含量显著降低(P＜ 0.05)。P-Akk显著降低肠道组织中GLP-1a、GLP-1b的含量(P＜ 0.05)。不同浓度的P-Akk处理原代肠细胞1 h后GLP-1a含量无显著性差异，GLP-1b在P10组显著降低(P＜ 0.05)。3 h后，GLP-1a、GLP-1b在P9组、P10组显著降低(P＜ 0.05)。P-Akk处理6 h后，GLP-1a含量无显著变化，GLP-1b含量相对于P0组显著降低(P＜ 0.05)(图5)。

P-Akk处理显著升高pi3k的mRNA表达量，pfk、ampk1的mRNA表达水平在MP组显著升高，gk的mRNA表达量在MP组、HP组显著升高，pepckmRNA表达水平在MP组显著降低(P＜ 0.05)(图6)。

图6 不同浓度P-Akk对鲤肝脏糖代谢相关基因表达的影响Fig. 6 Effects of different P-Akk levels on the expression of glucose metabolism related genes in liver of C. carpio1. gk, 2. pfk, 3. gys, 4. g6pase, 5. pepck, 6. pygl, 7. ampk1, 8. ampk2, 9. akt, 10. pi3k.

原代肝细胞孵育结果显示，P-Akk处理后gk、pfk、gysmRNA表达水平显著升高(P＜ 0.05)。P-Akk处理3 h后，pi3k的mRNA表达量在高浓度组显著升高，6 h时，ampk2在P8组、P9组显著升高，其他基因无显著变化(P＞ 0.05)(图7)。

图7 不同浓度P-Akk对鲤原代肝细胞糖代谢相关基因表达的影响Fig. 7 Effects of different P-Akk levels on the expression of glucose metabolism related genes in primary hepatocytes cells of C. carpio(a) gk, (b) pfk, (c) pepck, (d) gys, (e) ampk1,(f) ampk2, (g) pi3k, (h) akt.

添加P-Akk后muc2 mRNA表达水平逐渐升高，并在MP组、HP组达到显著水平(P＜ 0.05)。肠细胞孵育实验结果显示，P-Akk显著升高黏蛋白muc2 mRNA表达水平，但6 h时各组间已无显著差异(P＞ 0.05)(图8)。

图8 不同浓度P-Akk对鲤肠道(a)和肠细胞(b) muc2 mRNA表达的影响Fig. 8 Effects of different P-Akk levels on the muc2 mRNA expression in intestine (a) and intestinal cells (b) of C. carpio

2.5 P-Akk对鲤SCFAs及其受体的影响

P-Akk处理后肠道内容物中乙酸、丙酸、异丁酸、丁酸、戊酸、异戊酸及总SCFAs含量相较于对照组都升高，并在MP组达到显著水平(P＜0.05)(图9)。

图9 不同浓度P-Akk对鲤肠道内容物中短链脂肪酸含量的影响Fig. 9 Effects of different P-Akk levels on the content of short chain fatty acids in the intestine of C. carpio

添加P-Akk后相较对照组，gpr40的mRNA表达量升高，其中g32在MP组、HP组显著升高，g34、g48-1、g48-4的mRNA表达量在MP组显著升高(P＜ 0.05)。原代肠细胞再次证明P-Akk显著升高g34、g48-1、g13的mRNA表达水平(P＜ 0.05)(图10)。

图10 不同浓度P-Akk对鲤肠道(a)和肠细胞(b) (c) (d) (e)gpr40 mRNA表达的影响Fig. 10 Effects of different P-Akk levels on the gpr40 mRNA expression in the intestine (a) and intestinal cells (b) (c) (d) (e) of C. carpio(a) 1. gpr40-g32, 2. gpr40-g34, 3. gpr40-g48-1, 4. gpr40-g48-4; (b) gpr40-g31; (c) gpr40-g34; (d) gpr40-g48-1; (e) gpr40-g13-1.

3 讨论

碳水化合物作为自然界常见的能源物质添加到饲料中可以起到节约蛋白质、降低成本的作用，但不同环境、食性的鱼类对碳水化合物的利用能力不同，饲料中糖类过高或过低均会导致肠道菌群紊乱，对鱼体产生不利影响，如降低生长性能[22]、诱导肝脏和肠道损伤等。鲤作为杂食性鱼类对糖类物质的耐受能力相对于其他食性的鱼类较高，但是这种能力不足以使鲤完全消化饲料中的糖类物质。摄入高糖后鱼体血糖含量随饲料中糖水平的升高而持续上升[23]，诱导肝脏、肠道损伤，肠道菌群紊乱[24]，长期高糖毒性使得活性氧及炎性介质增加，进而损伤肠道L细胞，导致GLP-1分泌缺陷，具体表现为GLP-1分泌减少、肠道炎症反应、肠道菌群失调、胰岛素抵抗等[25]。本研究发现，高糖饲料显著增加鲤的末重、肝体比、脏体比和肥满度，且40%的葡萄糖添加组效果较为显著，与大黄鱼(Larimichthys crocea)和点带石斑鱼(Epinephelus coioides)的研究结果类似[26]。此外，随着葡萄糖添加水平升高，血清及肠道中GLP-1a、GLP-1b含量降低，表明高糖饲料抑制肠道组织中GLP-1分泌，推测GLP-1具有升血糖的作用，但具体作用机制尚不清楚。

肠道微生物与宿主之间相互影响，具有营养、防御和免疫调节等生理功能，能够促进机体生长发育[27]。Akk作为二代益生菌，其丰度与机体代谢疾病相关，在各种肥胖或其他代谢紊乱的小鼠模型中显著减少，具体表现为瘦素缺陷型[18]、高脂饲料饲喂[28]、T2DM小鼠等，添加Akk或巴氏灭活的Akk能够改善肥胖、胰岛素抵抗、肝脏脂肪变性等代谢综合征[15]，调节高脂、高糖饮食引起的代谢紊乱，且109CFU/mL的Akk灭活后效果相对更好[29-30]。本研究发现，高糖饲料显著降低鲤肠道内容物中厌氧菌Akk丰度，用P-Akk处理后鲤血清中葡萄糖、TG含量显著降低，肝脏糖酵解基因mRNA表达水平显著升高、糖异生基因mRNA表达量显著降低，表明P-Akk通过调控糖代谢相关酶活力及基因表达调控机体糖代谢过程，降低血糖含量，即P-Akk同Akk一样能够调节糖、脂代谢，缓解高糖饲料引起的代谢紊乱[31]。Dan等[32]研究发现，肠绒毛密度、高度和肌层厚度对增加食糜接触面积、促进消化吸收至关重要，随饲料中碳水化合物水平的升高而降低，目前，关于不同糖类及糖水平对鱼类肠道健康的影响已有报道，对高体大鳞鲆(Tarphops oligolepis)的研究发现，添加适宜水平的水苏糖使得远端小肠褶皱增多，绒毛高度增加，表明适宜的水苏糖促进肠道对营养物质的吸收，维护肠道健康[33]。肠道组织形态观察结果显示高糖饲料导致鲤肠绒毛破裂，微绒毛稀疏，肌层厚度显著变薄，表明高糖饲料破坏鲤肠道黏膜屏障，降低肠道对营养物质的吸收能力，导致肠道损伤，而P-Akk处理后肠绒毛高度和肌层厚度显著增加，肠道损伤情况明显改善，表明P-Akk缓解高糖饲料诱导的肠道损伤，促进糖类物质消化吸收。肠绒毛之间分布大量杯状细胞，能够合成并分泌黏蛋白，使黏液层增厚，增强肠道屏障功能，保护肠道健康[34]。黏蛋白具有聚糖、结合水的能力，能够孵育黏液保持潮湿和润滑，保护肠上皮细胞免于脱水和机械应力，形成肠道黏膜保护屏障[35]。同时，黏蛋白还能够为Akk等细菌的生长供能，促使其在肠道中定植。Akk是一种能够分解利用黏蛋白作为营养物质的黏液降解菌，Akk分解黏蛋白产生乙酸、丙酸等短链脂肪酸，又可以诱导黏蛋白的分泌[36]。本研究发现，P-Akk处理后黏蛋白数量增多，muc2的mRNA表达水平显著升高，SCFAs含量增加，gpr40 mRNA表达量升高，推测P-Akk促进包括Akk在内的产SCFAs菌在肠道中的定植，且109CFU/g效果较为显著。

Akk代谢产生乙酸、丙酸等短链脂肪酸，进而通过G蛋白偶联受体(GPR)影响肠道上皮L细胞分泌GLP-1，GLP-1是一种强效肠促激素，能够调控胰岛β细胞分泌胰岛素，在调节葡萄糖稳态中具有重要作用[37]。哺乳动物和硬骨鱼类由不同的代谢途径调控，其中几种主要激素的功能存在差异，尤其是胰岛素和GLP-1[38]。在哺乳动物中，GLP-1通过抑制胰岛α细胞分泌胰高血糖素，同时刺激胰岛β细胞分泌胰岛素，以达到降低血糖的目的[39]。在鱼类中，GLP-1对葡萄糖的调控作用类似胰高血糖素，促进糖质新生和肝糖原降解[40]，升高血糖含量。本研究发现随着葡萄糖添加水平升高，血清及肠道中GLP-1a、GLP-1b含量降低，GLP-1a、GLP-1b与受体结合后激活AMPK、PI3K/AKT信号通路，调节糖代谢相关酶活力及基因表达，促进肝脏糖异生、抑制糖酵解，升高鲤血糖含量。养殖实验及细胞实验发现PAkk处理后GLP-1a、GLP-1b含量减少，同时伴随血糖含量的降低，结合糖代谢基因检测结果，推测P-Akk影响GLP-1分泌，激活下游信号通路，如AMPK、PI3K/AKT，调控机体糖代谢，与Everard等[18]的研究结果一致。

目前，添加益生菌已经成为促进水产养殖业绿色发展的重要战略手段，Akk作为二代益生菌具有良好发展前景。近年来，关于Akk的研究多集中在人类及哺乳动物上，Akk在鱼类中的作用机制研究还需要不懈努力。本实验室前期研究发现Akk能够调控肠道中GLP-1分泌，本研究进一步证实饲料中添加P-Akk的确可以通过介导GLP-1分泌调控鲤糖代谢。这一结果可为P-Akk调控鲤糖代谢提供理论依据，解决了活菌添加不易的难题，且安全性有保障，更有希望广泛使用。

4 结论

综上，鲤自身具有一定糖代谢调节能力，通过肝脏糖酵解及糖异生途径抵抗高糖饲料引起的血糖升高，但糖类水平过高会诱导鲤血糖升高，造成肝脏、肠道损伤。外源添加P-Akk能够增加鲤肠道内容物中短链脂肪酸含量，抑制肠道分泌GLP-1，缓解高糖饲料引起的血糖升高，维持葡萄糖稳态。该研究结果可为Akk作为益生菌在水产饲料中的应用提供理论基础和实践依据。

（作者声明本文无实际或潜在的利益冲突）