两种芒萁覆盖度下毛竹林土壤酶活性及生态化学计量特征比较研究

董国鑫，黄雪蔓＊，王 一，任立宁

(1. 广西大学 林学院，广西 南宁 530004；2. 国际竹藤中心 竹藤科学与技术重点实验室，北京 100102；3. 四川长宁竹林生态系统国家定位观测研究站，四川 宜宾 644000；4. 中国林业科学研究院林业研究所，北京 100091)

土壤酶作为土壤生物产生的高效活性物质，催化大分子有机物分解为易被植物和微生物同化利用的碳源和养分，进而参与生态系统碳（C）、氮（N）、磷（P）循环过程[1]。常见的土壤酶通常被分为C 循环酶：β-葡糖苷酶、多酚氧化酶和过氧化物酶，N 循环酶：N-乙酰-葡糖苷酶和亮氨酸氨基肽酶，P 循环酶：酸性磷酸酶。越来越多的研究表明：除了温度和湿度等环境因子外，土壤养分、底物供应（凋落物输入）和土壤微生物群落组成也是调控土壤酶活性的重要因子[2-4]。“资源配置理论”[5]和“最优分配原则”[6]认为在参与调控土壤C、N、P 循环过程中，土壤生物优先分配给缺乏的资源以缓解土壤碳和养分的限制作用，说明C、N、P 循环酶产量应对生物和非生物因子变异的协同和权衡响应。基于此形成的土壤酶生态化学计量特征可以定量的表述土壤微生物受到C、N、P 的相对限制作用[7]。已有研究多关注于土壤酶活性对生物和非生物因子变化的响应，近年来，越来越多的研究利用土壤酶生态化学计量特征表征地下生态学过程中的元素限制作用。

毛竹（Phy llostachys edulis(Carr. ) Lehaie）作为我国面积最大，分布最广的竹种，广泛分布于我国亚热带地区[8]。芒萁（Dicranopteris dichotoma(Thunb. ) Berhn.）是毛竹林常见并广泛分布的林下植被，在粗放式经营毛竹林中呈强烈聚集分布[9-10]。芒萁可与毛竹竞争P 元素，加剧竹林P 元素限制作用[11]。此外，芒萁和毛竹凋落物的异速分解过程也势必会改变竹林土壤底物供应[12-13]。土壤养分和底物供应的变化如何影响土壤酶活性及其生态学计量特征尚不清楚。以往的研究多关注于毛竹林经营措施、林地转化和模拟气候变化背景下土壤酶活性的变化[14-16]，对毛竹林下植被如何影响土壤酶活性的研究较少，这也限制了深入探索在毛竹林高效培育过程中林地生产力的长期维持能力。土壤团聚体是土壤结构的基本单元，不同粒径团聚体的可接触性、养分含量和微生物群落组成等性质的差异直接影响着土壤酶活性，进而影响土壤C 固持和养分供给[17]。先前研究发现，不同芒萁盖度下的毛竹林土壤团聚体组成和养分具有明显差异[11]。区分土壤团聚体组成及与之相关的土壤酶活性可以比未进行团聚体分级的混合土壤更有效、快速的反映土壤养分循环的变化[3,18]。因此，了解团聚体酶活性变化特征，对掌握竹林土壤养分变化具有重要的意义。本研究以四川省长宁县粗放经营的毛竹林为研究对象，探究不同盖度芒萁对毛竹林土壤团聚体酶活性及生态化学计量特征的影响，以期为深入认识林下植被不同盖度下毛竹林地力差异和制定高效经营措施提供科学依据和基础数据。

1 材料和方法

1.1 试验区概况

研究地点位于四川省宜宾市长宁县蜀南竹海自然保护区（28°15'～28°47' N，104°44'～105°03' E），研究区属中亚热带湿润性季风气候，年均气温18.3 ℃，年均降雨量1 114.2 mm，研究区主要有毛竹、硬头黄竹（Bambusa rigidaKeng et Keng f.）、 慈竹（Neosinocalamus affinis(Rendle)Keng） 和苦竹（Pleioblastus amarus(Keng)keng）等竹种[19]。本研究试验地依托四川长宁竹林生态系统国家定位观测研究站毛竹林观测点，所选试验地林分近十年无施肥、劈山和勾梢等经营，毛竹林下常见大面积的芒萁种群集中连片分布，少量混杂狗脊（Woodwardia japonica(L.f.) Sm.）和里白（Hicriopteris glauca(Thunb.) Ching）等蕨类，土壤为山地黄壤[19-20]。

1.2 样地设置

样地设置见王一等[11]，具体为：2016 年3 月在四川长宁竹林生态系统定位观测研究站毛竹林观测点选择海拔、坡度和坡向一致，长势良好的毛竹林为研究对象，在林下芒萁稀疏分布（芒萁盖度7.75%）的毛竹林内设置4 个面积为20 m × 20 m样方（PE）；同时，在林下芒萁强烈聚集分布（芒萁盖度63.25%）的毛竹林内设置4 个相同面积的样方（DD），保持样方之间相隔距离在150 m以上。同年6 月对样地内全部毛竹进行统计，研究地信息见表1。

表1 研究地基本情况Table 1 Stand characteristics of Phyllostachys edulis

1.3 土壤样品采集与团聚体分级

2016 年7 月在PE 和DD 样方设置两条对角线，并在交点处及距交点东、南、西、北5 m 处共设置5 个采样点，去掉采样点地表植被和凋落物层，用直径10 cm 的PVC 管采集采样点0～10 cm土层原状土[11]。将原状土带回实验室并沿土壤自然纹理掰开，去掉可见根系和石砾后过8 mm 筛并将同一样方样品混合均匀，采用四分法取样后对土壤团聚体进行分级。为保证筛分效果并减少对土壤微生物和酶活性的影响，土壤样品在4 ℃下风干至含水量15%左右进行再进行分级，具体为：称取100 g 土壤样品置于震动筛分仪（Retsch AS200）2 mm 和0.25 mm 土壤筛，设置1.5 mm 振幅震动2 min，将土壤团聚体分为大团聚体（＞2 mm）、中团聚体（0.25～2 mm）和微团聚体（＜0.25 mm）3 个团聚体粒径[11]。

1.4 土壤化学性质测定

采用元素分析仪（ECS 4010 CHNSO, Costech Analytical Tecnologies Inc., Vlencia, CA, USA）测定分级后土壤团聚体的有机碳（SOC）和全氮（TN）含量，采用化学分析仪（Smartchem 300,AMS-AllianceWestco Scientific Instruments,Rome, Italy）结合H2SO4/HClO4消煮法测定全磷（TP）含量[21]。

1.5 土壤酶活性和微生物测定

分级后的土壤团聚体采用荧光微平板法测定土壤酶活性[2,22]：将1.25 g 鲜土加入125 mL 50 mmol·L-1的醋酸钠缓冲液（pH=4.2）中，在搅拌机中匀速搅拌1 min 制成土壤悬液。加入酶底物进行25 ℃暗培养3 h 后添加5 μL 0.5 mol L-1NaOH 溶液停止反应，采用酶标仪（Perkine-Elmer LAMBDA 35）进行读数。本研究共测定参与土壤碳、氮、磷循环的4 种关键水解酶活性和2 种氧化酶活性：β-葡糖苷酶（BG）、N-乙酰-葡糖苷酶（NAG）、亮氨酸氨基肽酶（LAP）和酸性磷酸酶（AP）、多酚氧化酶（PHE）和过氧化物酶（PER）（表2）。

表2 土壤酶种类和功能Table 2 Soil enzyme and function

土壤C、N、P 循环相关的酶生态化学计量特征计算如下[7]：

土壤微生物群落结构测定采用磷脂脂肪酸法（PLFAs），依据Bossio 和Scow[23]提取和分析土壤微生物磷脂脂肪酸方法改进而来，主要过程分为土壤浸提-分离-纯化-萃取，通过酯化形成脂肪酸甲酯，利用Aligent 6 890 气象色谱测定土壤微生物特征类群脂肪酸含量，以正十九烷脂肪酸（19:00）内标物进行定量计算。在土壤微生物特征类群脂肪酸中[24-27]，革兰氏阳性菌（GP）由i14:0，i15:0，a15:0，i16:0，i17:0 和a17:0 组成，革兰氏阴性菌（GN）由16:1w7c，16:1w9c，17:1w8c，18:1w7c，cy17:0 和cy19:0 组成，丛枝菌根真菌（AMF）由16:1w5c 组成，真菌（F）由18:1w9c，18:2w6c 和18:3w6c 组成，放线菌（ACT）用Me16:0，Me17:0 和Me18:0 组成，细菌群落（B）由14:0，15:0，16:0，17:0 以及放线菌、革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌组成。

1.6 数据处理和统计分析

采用T 检验比较PE 和DD 样方芒萁盖度、立竹株数、新生竹株数、新生竹胸径、土壤团聚体相同粒径的土壤化学性质、酶活性及生态化学计量比、土壤微生物量和群落结构之间的差异，采用单因素方差分析比较相同样方内不同团聚体粒径土壤化学性质、酶活性及生态化学计量比、土壤微生物量和群落结构之间的差异。采用Canoco 4.5 进行冗余分析，采用SPSS 16.0 统计分析软件对数据进行差异性检验，采用SigmaPlot 12.5 软件制图。

2 结果与分析

2.1 不同芒萁盖度毛竹林土壤化学性质和微生物特征

PE 样方SOC、TN 和TP 含量在3 种团聚体间无差异，而DD 样方SOC、TN 和TP 含量整体呈现随团聚体粒径减少而增加的趋势，其中微团聚体SOC 和TP 含量均显著高于大团聚体，中团聚体TN 含量显著高于大团聚体（表3）。DD 样方中3 种团聚体粒径的TP 含量均显著低于PE 样方，但仅大团聚体和中团聚体TN 含量以及大团聚体SOC 含量显著低于PE 样方（表3）。PE 样方ACT、AMF、GN、GP、B 和F 含量均呈现随团聚体粒径减少而增加的趋势，其中微团聚体不同类群土壤微生物量显著高于大团聚体和中团聚体（除AMF 和F 外）；而DD 样方ACT、AMF、GN、GP、B 和F 含量在3 种团聚体间均无差异（表3）。除DD 样方大团聚体ACT 含量显著低于PE 样方外，其余类群土壤微生物量在相同团聚体粒径的不同样方之间无显著差异（表3）。

表3 不同芒萁盖度毛竹林土壤团聚体化学性质和微生物特征Table 3 Soil chemical properties and microbial properties of soil aggregate size classes in different plots

2.2 不同芒萁盖度毛竹林土壤酶活性和生态化学计量特征

PE 样方BG 和LAP 活性均随团聚体粒径减少而增加，PER 活性随团聚体粒径减少而减少，PHE 活性在中团聚体最高，而AP 和NAG 活性在团聚体不同粒径间差异不显著（图1）。DD 样方BG、NAG 和PHE 活性均在中团聚体最高，PER活性随团聚体粒径减少而增加，AP 和LAP 活性在不同团聚体粒径间差异不显著（图1）。DD 样方大团聚体和中团聚体LAP 和PHE 活性显著高于PE 样方，PER 活性显著低于PE 样方，BG 和NAG 活性在相同团聚体粒径不同样方间无差异，DD 样方3 种团聚体粒径AP 活性均显著高于PE 样方（图1）。PE 样方EC:N和EN:P在不同团聚体粒径间差异不显著，EC:P随团聚体粒径减少而增加（图1g～i）。DD 样方EC:N和EC:P随团聚体粒径减少而增加，微团聚体EC:N和EC:P均显著高于大团聚体；而微团聚体EN:P显著低于大团聚体。相同团聚体粒径不同样方间EC:N无显著差异，且大团聚体和中团聚体EN:P和EC:P在PE 和DD 样方间差异不显著，但PE 样方微团聚体EN:P和EC:P均高于DD 样方（图1g～i）。

图1 不同芒萁盖度毛竹林土壤团聚体酶活性和生态化学计量特征Fig. 1 Soil enzyme activities and stoichiometry of soil aggregate size classes in different plots

主成分分析发现PE 和DD 样方土壤酶活性呈现差异：PE 和DD 样方LAP 和PHE 均与第1 主成分正相关，PER 均与第1 主成分负相关；PE 样方NAG 与第2 主成分负相关，而DD 样方AP 与第2 主成分正相关（图2 和表4）。同一团聚体粒径土壤酶活性在PE 和DD 样方亦呈现差异；大团聚体和中团聚体AP 和PHE 中均与第1 主成分正相关，PER 均与第1 主成分负相关，大团聚体BG 与第2 主成分正相关，微团聚体中LAP 与第1 主成分负相关，PER 与第1 主成分正相关（图3和表4）。

图2 不同芒萁盖度毛竹林土壤酶活性主成分分析Fig. 2 Principal component analysis of soil enzyme activities in different plots

图3 不同团聚体粒径毛竹林土壤酶活性主成分分析Fig. 3 Principal component analysis of soil enzyme activities in soil aggregate size classes

表4 不同芒萁盖度和不同团聚体粒径毛竹林土壤酶活性主成分分析因子载荷矩阵 Table 4 Factor loading matrix for principal component analysis of soil enzyme activity in different plots and soil aggregate size classes

2.3 不同芒萁盖度毛竹林土壤酶活性和生态化学计量特征与土壤化学性质和微生物特征冗余分析

冗余分析结果表明：AMF 极显著影响了PE 样方不同团聚体粒径土壤酶活性的变异，而TP 和ACT 显著影响了DD 样方不同团聚体粒径土壤酶活性的变异（图4）。TN 和F 显著影响了PE 和DD 样方大团聚体土壤酶活性变异，TP 显著影响了PE 和DD 样方中团聚体土壤酶活性的变异，ACT 是影响微团聚体土壤酶活性的变异的重要因子（图5）。

图4 不同芒萁盖度毛竹林土壤酶活性和土壤化学性质和微生物特征冗余分析Fig. 4 Redundancy analysis of soil enzyme activity, soil chemical properties and microbial characteristics in different plots

图5 不同团聚体粒径毛竹林土壤酶活性和土壤化学性质和微生物特征冗余分析Fig. 5 Redundancy analysis of soil enzyme activity, soil chemical properties and microbial characteristics in soil aggregate size classes

3 讨论

3.1 不同芒萁盖度对毛竹林土壤酶活性的影响

作为参与土壤C 循环重要的酶，BG 活性受到土壤有机碳含量和质量等因素影响[28]。本研究发现：DD 样方不同团聚体粒径BG 活性均与PE 样方无显著差异（图1a），与BG 活性相似，DD 和PE 样方中团聚体和微团聚体SOC 无显著差异，且不同团聚体粒径SOC 与BG 均呈负相关关系（表3 和图5a～c），本研究之前也发现DD 和PE样方不同团聚体粒径土壤碳氮比无显著差异[11]，故芒萁种群并未改变不同团聚体粒径SOC 和土壤碳氮比可能是导致BG 活性无差异的原因。与BG 不同，研究发现参与土壤P 循环的AP 活性在不同团聚体粒径间DD 样方均高于PE 样方（图1b），而不同团聚体粒径TP 含量DD 样方均低于PE 样方，且不同团聚体粒径TP 与AP 均呈负相关关系（表3 和图5a～c），这可能是因为微生物-植物在低磷环境下需要分泌更多的磷酸酶将有机磷转化为无机磷供生物体利用[6]。这也进一步验证了之前的研究发现，即芒萁种群增加了其与毛竹对不同粒径团聚体P 的竞争作用[11]，故DD 样方AP 活性显著高于PE 样方。与AP 相似，参与土壤N 循环的LAP 活性仅在大团聚体和中团聚体具有差异（图1c），这是因为DD 样方TN 仅在大团聚体和中团聚体低于PE 样方（表3），且LAP 活性和TN 在大团聚体和中团聚体均呈现负相关关系（图5a～b）。综上发现，在参与土壤C、N、P 循环的水解酶活性中，芒萁种群显著增加了大、中、微团聚体AP 活性，且显著增加了大和中团聚体LAP 活性，但对BG 活性无影响。与前期开展生态化学计量研究结果相同，芒萁种群对P 的竞争利用强于对N 的竞争利用[11]，土壤生物体需要分泌更多的酶以开采土壤氮磷养分满足自身生长所需[6]，故在DD 样方全部团聚体粒径中AP 活性均高于PE 样方，而仅有大和中团聚体LAP 活性高于PE 样方（图1b～c）。

除水解酶外，氧化酶通过氧化还原作用参与土壤有机质的矿化作用。多酚氧化酶（PHE）氧化土壤中酚类和胺类物质，过氧化物酶（PER）氧化土壤中木质素等大分子，进而共同决定土壤有机质分解并反映土壤腐殖化和有机化程度[28-29]。由于芒萁具有较高的酚类物质[30]，并将酚类物质分泌到土壤中通过化感作用抑制其他植物生长[31]。本研究发现DD 样方大团聚体和中团聚体PHE 活性显著高于PE 样方（图1e），这可能是因为DD 样方芒萁种群导致土壤中酚类物种含量增加，进而增加了PHE 活性[32]。与PHE 相反，DD 样方大团聚体和中团聚体PER 活性显著低于PE 样方（图1f）。前人研究发现[33]，与DD 样方相比，PE 样方烷基与氧烷基碳比例（Alkyl C/O-alkyl C）降低是导致SOC 稳定性降低的主要原因。这可能是因为木质素的芳香环结构及其与烷基碳的结合形成了稳定的SOC[34]，而PE 样方内较高的PER 活性可促进木质素氧化，打破了其与烷基碳的结合形式，导致Alkyl C/O-alkyl C 降低，降低了SOC 稳定性。此外，芒萁凋落物叶和细根中Alkyl C/O-alkyl C 均显著高于毛竹，这也进一步增加了DD 样方内SOC稳定性。氧化酶活性均在大团聚体和中团聚体表现出显著差异（图1e～f），这可能是因为氧化酶的合成和分泌主要受真菌调控，而真菌在大团聚体占优势地位[35]，故大团聚体和中团聚体氧化酶活性差异显著。

3.2 不同芒萁盖度对毛竹林土壤酶生态化学计量特征的影响

本研究发现，PE 样方不同团聚体粒径之间EC:N差异不显著（1.42～1.55），而DD 样方微团聚体EC:N显著高于大和中团聚体（1.27～1.73），这是因为DD 样方微团聚体NAG 活性显著降低（图1d）。之前研究表明，芒萁种群显著降低土壤TN 含量，且大团聚体和中团聚体TN 含量降低是导致DD 样方土壤TN 含量下降的主要原因[11]，故DD 样方大团聚体和中团聚体的微生物需要分泌更多的NAG 以保证氮素供给，冗余分析结果中EC:N与NAG 负相关关系也进一步证明了本研究的结果（图4b）。本研究中亦发现DD 样方微团聚体EN:P显著低于大和中团聚体（图1h），DD 样方微团聚体EN:P=0.43，接近于全球平均水平0.44[36]，而大和中团聚体EN:P位于0.54～0.57，说明DD 样方大和中团聚体受到P 限制作用更严重。这主要是因为DD 样方大和中团聚体与微团聚体TN 含量无差异，但大和中团聚体TP 含量显著低于微团聚体（表3），冗余分析结果中EN:P与TP 呈负相关关系也验证了微团聚体TP 含量增加缓解了P 限制作用（图4b）。由于土壤大团聚体对磷的解吸附能力强于微团聚体，大团聚体的磷元素更易被根系吸收利用[37]，因此可能导致大团聚体TP 含量降低。此外，DD 样方微团聚体EN:P和EC:P均低于PE 样方（图1h、i），这主要是因为DD 样方AP 活性显著高于PE 样方且AP 与EN:P和EC:P均呈负相关关系（图1b 和图5c）。土壤酶生态化学计量特征作为反映微生物碳和养分限制重要的指示因子，全球尺度土壤酶化学计量比（EC:N:P）约为1:1:1[36]。本研究中，PE 样方土壤大、中、微团聚体EC:N:P分别为1.46:1:2.03、1.40:1:1.83、1.52:1:1.97，DD 样方土壤大、中、微团聚体EC:N:P分别为1.25:1:1.86、1.31:1:1.75、1.71:1:2.33，均偏离与全球尺度土壤酶化学计量比，说明研究地受到P 限制作用，且芒萁种群加剧了P 元素的限制作用。除了P 限制作用外，EC:N:P亦可以表征研究地受到C 限制作用，但P 限制作用更强。根据“资源配置理论”[5]和“最优分配原则”[6]，土壤微生物分泌酶优先分配给缺乏资源以缓解土壤碳和养分限制作用，所以本研究发现研究区参与土壤P 循环酶活性（AP：842～2 221 nmol·g-1·h-1）和C 循环酶活性（BG：134～318 nmol·g-1·h-1）高于N 循环酶活性（NAG：18～76 nmol·g-1·h-1；LAP：5～13 nmol·g-1·h-1）。

3.3 土壤酶活性和生态化学计量特征的调控因子

受土壤化学性质和微生物特征影响，本研究发现PE 样方AMF 是影响土壤酶活性的主要原因（图4a），这可能是因为毛竹作为AMF 树种，菌根真菌可通过运输能量和养分等物质与毛竹形成共生关系[38]，故AMF 是影响参与土壤C、N、P 循环相关酶活性的重要因子。此外，菌根真菌作为调控土壤氧化酶合成和分泌的重要微生物类群[39]，RDA 分析中AMF 与LAP 和PHE 显著正相关，而与PER 显著负相关（图4a），因此土壤团聚体不同粒径之间AMF 的差异是影响不同粒径之间LAP、PHE 和PER 活性差异的主要原因（表3）。PCA 因子载荷矩阵亦发现PE 样方LAP 和PHE 均与第1 主成分正相关，而PER 与第1 主成分负相关，进一步说明了土壤团聚体不同粒径之间LAP、PHE 和PER 活性差异是土壤C、N、P 循环相关酶活性在土壤团聚体不同粒径之间分异的主要原因（图2a 和表4）。与PE 样方不同，TP 和ACT是影响土壤酶活性的主要原因（图4b）。这主要是因为芒萁种群加剧了P 元素的限制作用，因此，根据“利比希最小因子定律”，TP 显著影响了土壤酶活性的变异。在PCA 因子载荷矩阵分析中发现DD 样方AP 与第2 主成分正相关，且大团聚体和中团聚体AP 均与第1 主成分正相关也说明了磷元素在调控DD 样方土壤酶活性的重要作用（图2b 和表4）。ACT 作为土壤微生物重要的类群，其携带的phoC和phoD基因与AP 合成和分泌显著相关[40]，故在磷限制更为明显的DD 样方中，ACT 与AP 活性显著正相关（图4b），且是影响土壤酶活性变异的主要原因。

在不同团聚体粒径间，本研究发现大团聚体土壤酶活性变异主要受TN 和F 显著影响（图5a），而中团聚体土壤酶活性变异主要受TP 影响（图5b）。芒萁种群引起土壤养分（TN 和TP）的降低主要受大团聚体TN 和TP 含量降低调控，且对土壤养分贡献率的变化TN 大于TP[11]。PCA 因子载荷矩阵分析中大团聚体AP 和PHE 均与第1 主成分正相关，PER 与第1 主成分负相关，BG 与第2 主成分正相关（图3a 和表4）。RDA 分析中TN 亦与PER 正相关，与AP、PHE 和BG 负相关。因此，TN 是大团聚体中参与土壤C、N、P 循环相关酶活性变化的主要原因。此外，菌丝作为真菌的重要组成部分，微团聚体可以在菌丝互相缠绕下形成大团聚体[17,35]，故F 仅在大团聚体中显著影响土壤酶活性的变异（图5）。与大团聚体不同，TP 是影响中团聚体土壤酶活性变异的主要原因。这是因为先前研究发现芒萁细根可以利用中团聚体的P，导致对土壤养分贡献率的变化TP 大于TN[11]。因子载荷矩阵分析表明中团聚体AP 和PHE 中均与第1 主成分正相关，PER 与第1 主成分负相关（图3b 和表4）。RDA 分析中TP 亦与AP 和PHE 负相关，与PER 正相关，故TP 是中团聚体中参与土壤C、N、P 循环相关酶活性变化的主要原因。

4 结论

川南地区毛竹林下高盖度的芒萁种群未显著改变参与土壤C 循环的水解酶活性（BG），但改变了参与土壤C 循环的氧化酶活性（PHE 和PER），与此同时，显著改变了参与土壤N 和P 循环的水解酶活性（LAP 和AP）。土壤酶活性的改变主要发生在大团聚体和中团聚体内，说明不同团聚体粒径土壤酶活性对高盖度芒萁种群响应的敏感性具有差异。土壤酶生态化学计量特征分析表明了C 和P 在研究区生态系统中的限制作用，但P 限制作用更强，且毛竹林下高盖度的芒萁种群加剧了该作用。