鼠疫耶尔森菌低钙应答V抗原人源单克隆抗体筛选与鉴定

张 黎,郑滨洋,张 琪,吴海莲,潘红星,朱凤才,吴海生,周剑芳

鼠疫俗称黑死病,是由鼠疫耶尔森菌(Yersiniapestis,以下简称鼠疫菌)感染引起的一种自然疫源性烈性传染病,为我国法定甲类传染病[1]。人感染鼠疫后可表现为腺鼠疫、肺鼠疫和败血症鼠疫等,其中肺鼠疫发病急、传染性强(可通过飞沫传播),不及时治疗病死率可达100%。鼠疫在人类历史上共引起3次大流行,导致约1.6亿人丧生[2]。

鼠疫菌属于耶尔森菌属(Yersinia),该属的典型形态是短而粗、两极浓染的小杆菌,有荚膜,无鞭毛和芽孢的革兰阴性菌。鼠疫菌的主要保护性抗原为F1抗原和低钙应答V抗原(low-calcium response V antigen,LcrV),即V抗原。其中F1抗原为细菌荚膜,是鼠疫的主要保护性抗原[3]。抗F1抗体可协同干扰类鞭状体结构(injectosome)上的V抗原与免疫细胞间的整合,对抗病菌的入侵[4-5]。V抗原和其他分泌性耶氏菌外膜蛋白(Yersinia outer protein,Yop),如YopB及YopD等,由75 kb pCD1质粒编码,构成重要的III型分泌系统(type III secretion system, T3SS),是鼠疫菌感染入侵的基本毒力因子和诱导机体产生保护性应答的重要抗原[6-7],抗V抗体可阻止效应蛋白Yop的递送[8]。V抗原一直是鼠疫研究的热点,同样作为保护性抗原,V抗原和F1抗原具有协同保护效应,目前在研的鼠疫重组亚单位疫苗也都是采用F1+V的组合[9]。V抗原的单克隆抗体也具有与F1抗体协同保护效果,甚至非保护性的V抗体也能明显提高F1抗体的保护效果[10]。

本研究采用基因工程手段,从鼠疫疫苗临床试验受试者外周血中获得针对鼠疫V抗原的全人源单克隆抗体,初步评价鼠疫抗体与抗原结合特异性参数及对动物的保护效果,进而深入了解鼠疫的致病机制,为研究人体针对鼠疫抗原免疫应答奠定基础,为制备针对鼠疫的诊断及治疗制剂提供候选分子。

1 材料与方法

1.1 抗原、全血标本、菌株和实验动物 鼠疫耶尔森菌重组V抗原由兰州生物制品研究所保存并提供;5份全血标本来自于兰州生物制品研究所有限责任公司的鼠疫重组疫苗II期临床项目(临床试验批件号:2012L01329);鼠疫菌强毒株141株由青海地方病预防控制所鼠疫专业实验室分离鉴定并保存;BALB/c小鼠购自江苏华创信诺生物公司。克隆菌株DH5α、建库菌株XL1-Blue均由本室保存。

1.2 载体、细胞、试剂耗材 建库载体pComb3-XSS、抗体IgG表达载体pGI由本室构建及保存;HEK293F购自ATCC;人单核细胞系THP-1由本室保存;反转录试剂盒、PCR试剂购自TaKaRa公司;SfiI内切酶、T4链接酶购自NEB公司;TNF-α CBA试剂盒购自BD公司;其他化学试剂均为分析纯。

1.3 文库构建 经知情同意及伦理审查,从鼠疫疫苗II期临床项目中采集完成3次免疫后的志愿者全血标本共5份,每份采集10 mL抗凝血。使用Ficoll密度梯度离心分离外周血单个核细胞(PBMC),使用QIAGEN公司的RNeasy Mini Kit提取总RNA,然后采用Roche公司的第一链cDNA合成试剂盒Transcriptor First Strand cDNA Synthesis for RT-PCR进行反转录。根据文献报道方法扩增抗体的轻链及重链可变区基因,并且经过融合PCR链接成ScFv片段[11]。ScFv片段经SfiI酶切后与同样经SfiI酶切的pComb3XSS载体链接后电击宿主菌XL1-Blue感受态制备噬菌体抗体文库,噬菌体抗体文库经野生型辅助噬菌体VCSM13包装后进行后续筛选,具体方法按文献进行[12]。

1.4 文库筛选 按照结合、洗涤、洗脱、扩增的方式,对上述噬菌体展示抗体文库进行亲和淘选。将重组表达的鼠疫LcrV抗原包被于免疫管中进行固相化,包被浓度依次为500、300、200 ng/mL。具体步骤如下:向免疫管中加入相应量的LcrV蛋白,4 ℃包被过夜;弃上清,0.05% PBST 洗板3次,加入 3% BSA 37 ℃封闭 2 h;弃封闭液,0.05% PBST 洗板3次,加入抗体文库,37 ℃先振荡孵育1 h,再静置孵育1 h;弃上清,0.1% PBST洗涤10次,加入pH2.2的0.1 mol/L Gly-HCl洗脱,再用2 mol/L Tris中和至pH7.0,取10 μL测定滴度,剩余噬菌体感染XL1-Blue宿主菌后进行扩增,次日用PEG6000沉淀噬菌体再进行下一轮筛选。

1.5 阳性克隆鉴定 从第三轮筛选测滴度的平板上随机挑取96个单菌落于96孔深孔板中,37 ℃、260 r/min培养4 h,然后1∶10转接至新的深孔板中再震荡培养4 h,加入1 mmol/L IPTG 37 ℃诱导过夜。次日用间接ELISA法检测上清中抗体的表达,具体如下:首先将鼠疫LcrV抗原以200 ng/孔包被于96孔酶标板中,加入50 μL 3%脱脂牛奶和50 μL经IPTG诱导的细菌上清,37 ℃震荡孵育1 h,PBST洗板3次,加入HRP标记的抗M13噬菌体单克隆抗体,37 ℃孵育30 min后,PBST洗板,加入TMB显色液显色10 min,用2 mol/L硫酸溶液终止反应后读取OD450的吸光度值。阳性克隆提质粒后送测序,测序结果经IMGT数据库比对抗体可变区的基因序列,选取序列有差异的克隆进行全抗体表达。

1.6 抗鼠疫LcrV人源IgG1型全抗体表达 将LcrV抗体的重链可变区基因经AgeI和SalI酶切位点克隆入全抗体表达载体pGI-H,轻链基因经AgeI和Bsiw I酶切位点克隆入pGI-K载体。测序正确后,使用PEI转染试剂将双质粒共转染293F细胞,5 d后收取细胞上清,用Protein A柱纯化目的抗体。

1.7 LcrV人源抗体与LcrV抗原结合特异性鉴定 采用间接ELISA及Western blot法鉴定人源抗体与LcrV抗原的结合特异性。首先,将LcrV蛋白以200 ng/孔包被96孔酶标板,纯化抗体从1 μg/mL开始倍比稀释,一抗37 ℃孵育1 h,PBST洗涤后加入HRP标记的抗人IgG,然后37 ℃孵育30 min,后TMB显色,终止后读取OD450吸光度值,每个样品重复3次取平均值。然后,对目的抗体进行Western blot检测,将10 μg的LcrV蛋白经SDS-PAGE后,将PAGE胶上蛋白转印到PVDF膜中,经3%脱脂牛奶封闭及重组LcrV人源单抗孵育,洗涤后加入HRP标记的抗人IgG。最后用DAB直接在PVDF膜上显色。

1.8 抗体亲和力测定 本研究使用生物膜干涉技术(BLI)检测人源抗体与LcrV抗原结合的亲和力及动力学参数[13]。使用Pro A传感器将抗体固化于传感器表面,再与稀释后的LcrV抗原反应,通过分析表面光干涉的改变得到分子间相互作用的的信息。使用Octet Red 96 大分子作用仪实时监测整个结合及解离过程。具体操作方法参考仪器说明书。

1.9 重组单抗对LcrV抗原激活免疫细胞的影响 将THP-1细胞株以4×105/孔接种于12孔板中,加入5 μg/mL的PMA(Sigma, p8139)37 ℃培养48 h,换无血清Opti-MEM培养过夜。次日,将测试单抗以50 μg/mL与5 μg/mL的LcrV抗原先37 ℃孵育1 h,加入诱导分化的THP-1细胞中,只加5 μg/mL的LcrV抗原作为阳性对照,用THP-1细胞作为mock对照。所有细胞培养24 h后收集上清,用BD TNF-α CBA(CB45641127)试剂盒检测,以标准品浓度曲线计算待测上清中TNF-α浓度值。

1.10 动物保护试验 在青海省地方病预防控制所鼠疫专业BSL-3实验室完成该部分实验工作。每组4只6～8周龄雌性BALB/c小鼠,将500 μg/只的重组LcrV抗体提前24 h经腹腔注射小鼠,次日经皮下多点注射攻毒100 MLD的强毒标准株141鼠疫菌。同时用4只未免疫抗体的小鼠注射100 MLD强毒株做未免对照,用于验证毒株的毒力。完成免疫及攻毒后,将小鼠饲养在密封动物笼具中,每日记录小鼠死亡情况,对于死亡的小鼠进行解剖后,取心、肝、肺脏器进行压印平板培养鼠疫菌,对培养阳性菌用鼠疫菌特异性噬菌体裂解验证。

2 结 果

2.1 人源抗鼠疫耶尔森菌噬菌体文库的构建 收集了5份鼠疫疫苗接种自愿者的外周全血,通过密度梯度离心分离出PBMC,分别提取RNA和反转录,然后将cDNA等比例混合后用19对人ScFv引物分别扩增抗体的轻重链可变区基因。酶切后连接噬菌体载体,连接产物电击2次XL1-Blue感受态细胞,测定文库的库容量达7.54×108CFU,经菌落PCR验证文库中正确插入率为100%。

2.2 人源抗体的筛选及抗体序列分析 经3轮筛选后,挑取的96个单克隆菌落,经过IPTG诱导及噬菌体ELISA,确定OD450值>1.0的阳性克隆29个,经测序后得到轻重链序列完整的克隆26株,如图1。经过IMGT数据库比对序列,获得3株特异性单克隆抗体,分别命名为RV-B4、RV-D1、 RV-E8。3株抗体序列经IMGT数据库分析,发现RV-B4抗体的VH基因为VH1-46家族,轻链为Lambda 1-51;RV-D1和RV-E8重链均为VH3-30,轻链分别为Kappa链的VK3-20和VK1-39胚系基因,如表1所示。3株抗体的重轻链CDR区氨基酸序列如表2,其中RV-E8的重链CDR3长达22个氨基酸,这提示该抗体经历过较长的进化成熟,其亲和力理论上较高。

图1 噬菌体ELISA筛选文库中的目的抗体Fig.1 Using phage ELISA to select antibodies in library

表1 3株LcrV特异性抗胚系基因及变异度分析Tab.1 Germline variation and deviation analysis of 3 LcrV-specific antibodies

表2 3株LcrV抗体CDR区氨基酸序列比对Tab.2 Amino acid sequence alignment of 3 LcrV antibodies’ CDR

2.3 人源抗体与LcrV抗原结合特异性鉴定 为了进一步确定表达纯化的3株人源抗体与LcrV抗原结合的特异性,我们分别进行了抗体与LcrV重组蛋白的间接ELISA和Western blot实验。如图2A,3株人源抗体与LcrV重组蛋白ELISA结果显示此抗体均能与LcrV抗原特异性结合,且对该重组抗体的检测灵敏度可达3 ng/mL左右。Western blot结果显示2株抗体均能与LcrV抗原反应,在37 kDa处出现明显条带,同时此结果显示该抗体均识别抗原上的线性表位,如图2B。

注:A. 3株人源单抗与LcrV蛋白间接ELISA结果;B. 3株抗体与LcrV蛋白的Western blot结果;M. 相对分子质量标准;1、2和3分别为RV-B4、RV-D1和RV-E8抗体。图2 3株人源单克隆抗体与LcrV重组蛋白结合特异性鉴定Fig.2 Characterization of binding specificity of 3 mAbs to LcrV antigen

2.4 抗体亲和力测定 利用膜干涉技术,对3个人源单克隆抗体分别与LcrV抗原结合、解离数据进行分析。结果表明,3个鼠疫抗体与LcrV抗原都有很高的亲和力,其中RV-E8的KD值最高,为1.24 nmol/L,而RV-B4和RV-D1的KD值分别为2.1 nmol/L和42 nmol/L。见图3。

图3 3株人源抗体与LcrV抗原结合的动力学分析结果Fig.3 Kinetic analysis result of 3 human antibodies binding to LcrV protein

2.5 重组RV单抗对LcrV抗原免疫调节功能的影响 已发现的抗LcrV主要通过调理作用,干扰V抗原抑制单核细胞、中性粒细胞等吞噬细胞的吞噬功能和炎性应答。我们选择人单核细胞株THP-1为靶细胞系,用PMA在体外将其诱导分化为巨噬细胞,模拟研究LcrV抗原对吞噬细胞的免疫调节。发现与mock细胞相比出现,LcrV抗原刺激后,细胞活化,分泌高水平的TNF-α,将3株单抗分别与LcrV抗原预孵育后, 发现RV-D1抗体有下调TNF-α的趋势,但与阳性对照LcrV经非参数配对t检验,差异无统计学意义(P=0.25),如图4。提示这3株抗LcrV单抗体外干扰V抗原的免疫调节功能不显著,为进一步明确,我们进行了3株抗体的动物保护实验。

图4 单抗对LcrV抗原激活免疫细胞释放TNF-α的影响Fig.4 Effect of mAbs on LcrV-induced TNF-α releasing from THP-1 cells

2.6 动物实验结果 小鼠经过免疫单抗、鼠疫141强毒菌株攻毒后,发现所有动物均在观察期内死亡,包括只注射100 MLD的对照组动物。结果提示3株RV抗体均没有对BALB/c小鼠有免于死亡的保护作用,100 MLD的未免疫对照组小鼠也全部死亡,如图5A。所有死亡小鼠取心、肝、脾、肺脏经过压印赫氏平皿,次日平皿上均有菌落长出(图5B),经鼠疫菌鉴别噬菌体裂解验证,压印菌均出现红色虚线区域的清晰噬菌带(图5C),确认小鼠死亡皆由鼠疫菌导致。

注:A. 攻毒试验中小鼠生存曲线;B. 死亡动物心、肝、脾、肺压印赫氏平皿后细菌生长情况;C.鼠疫特异性噬菌体裂解鼠疫菌形成的噬菌带。图5 LcrV重组单抗对小鼠保护性试验Fig.5 Protection ability of anti-LcrV mAbs against Y. psetis

3 讨 论

虽然现在并非处于鼠疫大流行的时期,但是鼠疫仍然处于高度散发状态。根据WHO统计,2013-2018年全球共报告了2 886例鼠疫,其中死亡504例[14]。

F1单抗具有保护性已经得到了充分的验证,1997年美国陆军传染病医学研究所最早报道了1株针对F1抗原的F1-04-A-G1单抗,此抗体在小鼠模型中具有100%的保护力,由于安全原因,该抗体的序列至今没有公布[15]。2017年陈薇院士团队报道的F2H5鼠单抗,同样也是针对F1靶标,该抗体进行了人源化后100 μg即可对小鼠起到完全保护[16]。吴智远等[17]于2018年报道了1株针对F1的4C6鼠单抗。关于LcrV抗体报道的比较少,目前能检索到的仅Hill J等报道的mAb7.3单克隆抗体为第1个具有保护性的抗-V抗原抗体[10],后续又发现mAb7.3与F1-04-A-G1联用具有协同作用[18]。

据之前文献报道LcrV是通过识别免疫细胞表面的TLR2/6和CD14分子而进行免疫调节[19],然而,根据本研究从多个角度对3株单抗的生物学活性进行评测结果来看,此3株抗体虽为LcrV特异性人源单抗抗体,但是在体外并不能明显影响LcrV与TLR2/6和CD14分子的结合,进而减弱其对免疫细胞的进一步活化。同时,也没有在动物实验中表现出明显的动物体内保护性的效果,根据英国学者Hill J等[18]报道,LcrV单抗在与F1单抗连用时候可以明显提高抗体组合的保护效果,其说明LcrV单抗对F1单抗有一定的协同效应,本研究报道的3株单抗是否也具有此特性,有待进一步研究。

利益冲突：无