骨碎补UPLC指纹图谱与人骨肉瘤细胞MG63中碱性磷酸酶活性的谱效关系研究

陈香丽,张慧敏,张紫佳

上海中医药大学中药研究所 中药标准化教育部重点实验室,上海 201203

骨碎补是水龙骨科植物槲蕨(Drynariafortunei(Kunze) J.Sm.)的干燥根茎,其性温、味苦,归肝肾经。具有疗伤止痛、补肾强骨、消风祛斑的功效[1]。现代药理和临床研究表明,骨碎补具有抗骨质疏松、促骨折愈合、肾保护、抗炎、促进牙齿生长等作用[2]。化学成分研究表明骨碎补中的主要活性成分为黄酮类、三萜类、苯丙素类以及酚类等[3]。有大量研究表明,骨碎补在治疗骨骼相关疾病中具有显著疗效,且体外试验表明骨碎补可促进成骨细胞的成骨分化能力[4-7],但对于骨碎补中具体起作用的药效成分研究还未见报道。碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)是成骨细胞分化成熟的标志物,通过ALP的活性水平变化可以判断成骨细胞的分化能力。因此本实验通过UPLC指纹图谱与人成骨肉瘤MG63细胞的ALP活性谱效关系进行分析,探讨骨碎补作用于成骨细胞的主要成分。

中药谱效相关评价模式是将化学成分指纹图谱与其药效作用相结合,使指纹图谱中化学成分体现出相应的药效,同时阐明指纹图谱特征峰与药效的相互关系,确定相应的药效物质基础,从而对中药进行质量控制和药效评价[8,9]。

本研究建立骨碎补生品和烫品UPLC指纹图谱并用UPLC-Q-TOF MS技术对其化学成分进行鉴别,采用灰色关联度、双变量相关性分析和偏最小二乘法构建骨碎补指纹图谱和ALP活性的谱-效关系,为阐明骨碎补的药效物质基础和质量控制提供一定的参考依据。

1 材料与方法

1.1 仪器与材料

1.1.1 仪器

Waters 超高效液相色谱仪(美国Waters公司);ACQUITY UPLC HSS T3柱(2.1 mm × 100 mm,1.8 μm);Q-TOF液质联用仪(安捷伦液相色谱-G650系列四极杆-飞行时间质谱联用仪)。

1.1.2 试剂与材料

柚皮苷(批号:10236-47-2,纯度:大于98%,成都植标化纯生物技术有限公司);DMEM培养基(批号:11995081,Gibco);碱性磷酸酶(ALP/AKP)测试盒(微板法)(批号:A0529-2-2,南京建成生物工程研究);PierceTM BCA蛋白定量试剂盒(批号:23227,Thermo Fisher Scientific,USA);色谱级甲醇、甲酸(Fisher公司);分析级75%乙醇(国药集团化学试剂有限公司)。实验所用骨碎补药材购自亳州中药材市场,由上海中药标准化中心吴立宏研究员鉴定为水龙骨科植物槲蕨Drynariafortunei(Kunze) J.Sm的干燥根茎,标本编号为20201001-7,保存在上海中医药大学中药研究所,骨碎补药材产地信息详见表1,其中烫品1～3(DRT 1～3)分别由生品1～3按照《中华人民共和国药典》(2020年版一部)方法经砂烫制得。

1.2 方法

1.2.1 供试品溶液的制备

取样品粉末0.25 g,精密称定,置具塞锥形瓶中,精密加入75%乙醇20 mL,称定重量,45 ℃超声提取30 min(功率180 W,频率40 kHz),放冷,再称定重量,用75%乙醇补足减失的重量,摇匀,滤过,取续滤液,即得。

1.2.2 色谱分析条件

采用ACQUITY UPLC HSS T3(2.1 mm ×100 mm,1.8 μm)色谱柱,甲醇(A)和0.1%的甲酸水(B)为流动相,在25 ℃柱温条件下分离,流速 0.3 mL/min,进样量5 μL。

洗脱梯度:0～8 min,96%→92% B;8～11 min,92%→84% B;11～16 min,84%→82% B;16～19 min,82%→70% B;19～22 min,70%→65% B;22～27 min,65%→55% B;27～35 min,55%→45% B;35～38 min,45%→5% B。0～6.5 min的检测波长分别为283 nm;6.5～13 min的检测波长为260 nm;13～18 min的检测波长为283 nm;18～23 min的检测波长为260 nm;23～38 min的检测波长为283 nm。

1.2.3 质谱分析条件

质谱条件:扫描质量范围(m/z):100～1700;鞘气温度:250 ℃;鞘气流速:11 L/min;喷嘴电压:500 V;雾化器压力:45 psi;毛细管电压:3.5～4.0 kV;毛细管温度:350 ℃;干燥器流速:5 L/min;干燥器温度:300 ℃;碰撞能量:20～50 V。

1.2.4 骨碎补提取物ALP活性的测定

将10批骨碎补75%乙醇提取物,分别用DMSO配置成100 mg生药/mL的母液,0.22 μm微孔滤膜过滤,用于后期MG63细胞ALP活性评价研究。

将MG63细胞以2×105个/孔的密度将细胞接种于6孔板中,每孔的体积为2 mL。待细胞贴壁后给药,给药浓度为0.01 mg生药/mL,给药48 h后按ALP检测试剂盒说明书测定ALP活性。

1.3 数据分析

本实验数据的灰色关联度分析、双变量相关性及偏最小二乘回归分析采用SPSSPRO、SPSS21.0、SIMCA-14.1软件处理,细胞ALP活性用GraphPad Prism 9.0.0软件作图分析。

2 结果与分析

2.1 骨碎补指纹图谱的建立

2.1.1 精密度实验

取同一份骨碎补供试品溶液按“1.2.2”项下色谱条件连续进样6次,骨碎补各共有峰相对保留时间相对标准偏差(RSD<0.37%),相对峰面积RSD< 1.11%,表明仪器精密度较好。

2.1.2 重复性实验

称取6份同一批号的骨碎补,制备6份平行样品,依次进样分析,计算各共有峰相对保留时间及相对峰面积的RSD值。结果显示,共有峰相对保留时间RSD<0.05%,相对峰面积 RSD<1.67%,表明此方法重复性良好。

2.1.3 稳定性实验

同一份供试品溶液分别在 0、2、4、8、12、24、48 h按“1.2.2”项下色谱条件进行测定,计算各共有峰相对保留时间及相对峰面积。结果表明,相对保留时间RSD<0.34%,相对峰面积RSD<1.91%,表明供试品溶液在48 h内稳定性较好。

2.2 骨碎补UPLC指纹图谱的建立及相似度评价

按“1.2.1”项下方法制备5批骨碎补生品和5批骨碎补烫品的供试品溶液,再按“1.2.2”项下色谱条件进样测定,记录色谱图。将色谱数据导入《中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2012.1版)》,经多点校正后,采用中位数法生成骨碎补生品和骨碎补烫品的UPLC叠加指纹图谱。结果显示,5批骨碎补生品和5批骨碎补烫品共有12个共有峰(见图1)。5批骨碎补生品和5批骨碎补烫品指纹图谱的相似度均大于0.9,表明骨碎补生品与烫品相似度高,区分不明显(见表2)。

图1 骨碎补生品和烫品叠加指纹图谱

表2 5批骨碎补生品和5批烫品指纹图谱相似度

2.3 UPLC-Q-TOF MS鉴别骨碎补中的化学成分

将骨碎补生品和砂烫炮制品按“1.2.4”项下质谱条件采用UPLC-Q-TOF MS技术进行分析,通过MSDIL数据库、PubChem数据库和相关文献比对,鉴定骨碎补指纹图谱的共有峰,此外还从中鉴定出另外27个化合物。骨碎补炮制前后的总离子流图见图2,质谱鉴别结果见表3。

图2 骨碎补UPLC-Q-TOF MS总离子流图

表3 生、烫骨碎补化学成分的质谱数据及鉴定结果

2.4 骨碎补提取物指纹图谱与ALP活性之间的谱效关系分析

2.4.1 骨碎补提取物对MG63 ALP活性的影响

碱性磷酸酶(ALP)是成骨细胞分化成熟的标志物,通过ALP的活性水平变化可以判断成骨细胞的分化能力。将骨碎补的乙醇提取物以0.01 mg生药/mL的浓度作用于MG63细胞,并用10 nmol/L雌二醇(estradiol,E2)作为阳性对照,以不做任何处理的MG63细胞作为空白对照组(control,Con),测定细胞的ALP活性水平(按照说明书要求,以每克蛋白在37 ℃与基质作用15 min产生1 mg酚为1个金氏单位,ALP活性的单位记为:金氏单位/gprot)。结果表明同一批次骨碎补经砂烫后其提取物对MG63细胞的ALP活性的提升均比相对应的生品略高,但并无显著性差异(见图3)。

图3 骨碎补对MG63 细胞ALP活性的影响

2.4.2 骨碎补UPLC指纹图谱共有峰与ALP活性的相关性分析

2.4.2.1 灰色关联度分析

根据建立的指纹图谱,将骨碎补炮制前后的指纹图谱中标定的12个共有峰的单位峰面积与ALP活性进行相关性分析。采用SPSSPRO在线软件,对10批骨碎补药材中12个峰的单位峰面积与ALP活性进行灰色关联度分析。结果显示,1、2、6、8、11号峰的单位峰面积与ALP活性的灰色关联系数值在0.8～0.9之间,表示有相对显著影响,其余峰的单位峰面积与ALP活性的关联系数均大于0.9,表明关联度较高[21](见表4)。

表4 骨碎补中12个共有峰与MG63细胞ALP活性的灰色关联系数及双变量相关系数

2.4.2.2 双变量相关性分析

采用SPSS 21.0软件进行双变量相关性分析。结果显示,峰4、峰5与峰12与ALP活性的双变量相关系数呈正相关,且均大于0.3(见表4)。

2.4.2.3 偏最小二乘回归分析

利用 SIMCA-14.1软件,采用偏最小二乘回归分析法进行谱效相关性分析,计算得到12个共有峰与ALP活性的标准化回归系数和VIP值(见表5),VIP值越大,贡献率越高,VIP值>1时,自变量在解释因变量时具有重要意义[22]。峰1、峰2、峰4、峰5、峰10与峰12的回归相关系数为正值,说明与ALP活性正相关,其中,峰4、峰5、峰12的VIP值大于1,表明对ALP活性具有重要贡献,是ALP活性的重要变量,与双变量相关性分析结果一致。

表5 骨碎补中12个共有峰与MG63细胞ALP活性的标准化回归系数

综合分析灰色关联度、双变量相关系数、偏最小二乘回归系数和VIP值,可知峰4、峰5及峰12与ALP活性具有较高关联度,且呈正相关,对ALP活性的贡献度最大,是影响ALP活性的重要变量。由质谱分析结果确定峰4为咖啡酸-4-O-β-D-吡喃葡萄糖苷;峰5为儿茶素7-葡糖苷;峰12为柚皮苷。

在这三种成分中,仅柚皮苷可购买到对照品,将10 μmol/L柚皮苷作用于MG63细胞,并用10 nmol/L雌二醇(estradiol,E2)作为阳性对照,测定ALP活性,结果表明柚皮苷可显著促进MG63细胞中ALP活性(见图4),验证了相关性分析的准确性。

图4 柚皮苷对MG63 细胞ALP活性的影响

3 讨论与结论

本研究采用UPLC法结合多波长检测建立了骨碎补生品和烫品的指纹图谱,不同批次的骨碎补生品和烫品有12个共有峰,且相似度大于0.9,表明二者相似度高,区分不明显。ALP是成骨细胞分化成熟的标志物,是骨形成的生化指标之一。通过ALP的活性水平变化可以判断成骨细胞的分化能力。已有研究表明,骨碎补可促进成骨细胞分化[23]。本研究将骨碎补生品和烫品作用于MG63细胞,分析其对ALP活性的影响。结果表明,同一批次的骨碎补经砂烫后,可显著促进MG63细胞分泌ALP。为探究骨碎补中促进MG63成骨分化的活性成分,将ALP活性与指纹图谱标定的特征峰进行谱效相关性分析。为更全面分析骨碎补指纹图谱特征峰与ALP活性的谱效关系,本实验综合利用灰色关联度分析、双变量相关性分析和最小偏二乘回归分析三种方法,得出峰4、峰5、与峰12与ALP活性具有较高关联度,且呈正相关,对ALP活性的贡献度最大,是影响ALP活性的重要变量。

UPLC-Q-TOF/MS 技术具有选择性强、灵敏度高、样品前处理简单、高精度及高分辨率等特点,可以更全面、更快速的完成对骨碎补化学成分鉴定[24]。本研究利用UPLC-Q-TOF/MS在负离子模式下鉴别出骨碎补中的40个成分。确定对ALP活性具有重要贡献的成分为峰4咖啡酸-4-O-β-D-吡喃葡萄糖苷;峰5儿茶素7-葡糖苷;峰12柚皮苷并对柚皮苷的活性进行了验证。柚皮苷是一种黄酮类化合物,现代药理研究作用表明,柚皮苷可用于治疗或预防多种疾病,如抗骨质疏松、抗氧化、抗肿瘤、改善心肌损伤等[25-27]。现有研究也表明,柚皮苷是骨碎补药材中的重要活性成分[28]。而咖啡酸-4-O-β-D-吡喃葡萄糖苷和儿茶素7-葡糖苷的药理活性目前还未见报道,值得进一步开展研究。本研究结果对骨碎补质量控制及药效学研究具有一定参考意义。