新型一氧化氮比率型纳米探针的构建及性能研究

王晓丽，刘 浩，杜龙啸，吴可馨，张雨婷，周楠迪

（江南大学 生物工程学院 糖化学与生物技术教育部重点实验室，江苏 无锡 214122）

一氧化氮（NO）是一种重要的气体信号分子，由L-精氨酸在NO 合酶的作用下产生［1］。NO 在各种生理和病理进程中发挥重要作用，包括控制血管舒张、神经传递、血小板聚集、基因表达、免疫反应和细胞凋亡［2］。诸多研究表明，体内NO 水平的异常与多种疾病（如心血管系统疾病、中枢神经系统疾病及肿瘤）的发生发展密切相关［3］。因此，对NO 的相关研究逐渐成为寻求治疗某些生理学病变新方法的契机。而如何高灵敏及高选择性地动态监测NO水平，已成为研究人员亟需解决的首要问题［4］。

目前有多种检测NO 的技术和方法，包括光谱分析、电化学传感器、荧光法、电子顺磁共振光谱法以及色谱法，它们大都需要复杂的仪器设备，操作繁琐且耗时，因此难以达到快速和简便检测的目的［5-10］。表面增强拉曼散射（SERS）是一种具有分子指纹特性的振动光谱技术，具有操作简单、快速、灵敏、原位和无损检测等特点。更为重要的是，相对于荧光法，SERS具有出色的抗光漂白性和无自发荧光等显著优势，使其成为生物分子定量分析和成像的理想技术［11-13］。SERS的增强效果主要来自于贵金属材料（如Au 和Ag）的局域表面等离子体共振效应（LSPR）介导的电磁增强。贵金属材料的形貌、尺寸以及聚集状态均对LSPR 效应有很大的影响，特别是在尖端、间隙、孔隙等纳米尺度非常小的位置，会产生更显著的电磁增强，这些区域常被称为热点，是SERS信号增强的主要来源［14］。

然而，NO作为一种无机分子，拉曼截面较弱，不易被SERS直接检测［15］。研究发现，NO可和拉曼信号分子3，4-二氨基苯硫醇（DABT）上的邻苯二氨基反应生成苯并三唑，从而造成拉曼信号的变化。Cui 课题组［16］利用邻苯二胺修饰的金纳米颗粒特异性检测了活细胞的内源性NO，Li 等［17］通过氧化细胞色素c 在金纳米粒子/甘氨酸/石墨烯量子点复合物上结构转变引起的谱带变化，发展了一种利用SERS检测海水中NO 的新方法。Xing 等［18］开发了一种简单而独特的SERS 平台，用于精确而灵敏地原位监测单个细菌释放的NO。但现有检测NO 的SERS 探针仍存在灵敏度不高、选择性不强及背景信号干扰强烈等问题。此外，现有的SERS基底通常具有较差的SERS增强性能（Au）、较高的生物毒性（Ag）或易于不可逆聚集（Au和Ag）［19-20］。

本文结合纳米Au 的良好生物相容性及纳米Ag 的高SERS 增强性能，可控制备银包金纳米星（AuNSs@Ag）作为SERS基底。同时，利用DABT和NO反应前后未发生变化的拉曼特征峰作为内参，构建了一种比率型SERS 纳米探针用于快速灵敏地检测NO。首先以2-硝基-4-硫氰基苯胺为原料，通过两步反应合成了可以与NO特异性反应的拉曼分子DABT（图1A）。接着构建了比率型SERS纳米探针（如图1B），利用种子生长法以三水合四氯金酸为原料在柠檬酸三钠还原下制备AuNSs，然后通过硝酸银和抗坏血酸还原制备核壳结构的AuNSs@Ag，最后通过Ag—S键将DABT 修饰到AuNSs@Ag 表面，从而得到比率型纳米探针AuNSs@Ag-DABT。当NO 存在时，DABT 与NO 发生反应并在541 cm-1附近出现一个新的三唑环的拉曼峰，而在1 078 cm-1处的C—S 离面弯曲拉曼峰的信号强度（I1078）保持不变。随着NO 浓度的增加，比率型SERS 探针中541 cm-1处的拉曼信号强度（I541）逐渐增加，而I1078则不发生变化，因此可以根据I541/I1078的比值变化实现对NO 的定量检测。比率型检测具有内置校正达到避免环境干扰的目的，此外，由于DABT 对NO 的特异性识别，使得该传感器在其他干扰物质存在下对NO 具有较高的特异性。

图1 NO识别分子的合成路线（A）及SERS纳米探针的构建（B）Fig.1 Synthesis route of NO recognition molecule（A） and construction of SERS nanoprobe（B）

1 实验部分

1.1 材料、试剂与仪器

硝酸银（AgNO3，≥ 99.7%）、抗坏血酸（≥ 99.7%）、柠檬酸三钠（≥ 99.7%）、十二烷基硫酸钠（SDS，≥ 99.5%）、2-硝基-4-硫氰基苯胺、连二亚硫酸钠（≥ 99.7%）、氨水（NH3·H2O，≥ 99.8%）和氢氧化钾（KOH，≥ 99.7%）购于国药集团化学试剂有限公司；聚乙烯吡咯烷酮（PVP，≥ 99%）和三水合四氯金酸（HAuCl4·3H2O，≥99.9%）购于西格玛奥德里奇中国有限公司；三-（2-羰基乙基）-磷盐酸盐（TCEP，BC grade）、壬酸二乙胺（DEA NONOate，≥97%）购于上海阿拉丁生化科技股份有限公司；其他试剂均为市售分析纯。

ZEN3700 激光粒度仪（British Malvern Instruments Co.，Ltd.，ZEN3700）；透射电子显微镜（Japan Electronics Co.，Ltd.，JEM-2100）；紫外分光光度计（Hitachi，U-3900）；多功能酶标仪Biotek（United States Berton Instruments Co.，Ltd.，Synergy H4）；显微拉曼成像光谱仪（Thermo Fisher Scientific，DXR2xi）。

1.2 实验方法

1.2.1 DABT的合成与表征

称取3.51 g 2-硝基-4硫氰基苯胺（18 mmol）分批加入到10 ℃含6 g KOH 的乙醇（100 mL）溶液中，室温下搅拌30 min，然后加入含5%硫酸的乙醇溶液，混合物的颜色从深紫色变为橙色。将混合物倾入400 mL 水中，用3×100 mL 的乙酸乙酯（EA）萃取，合并有机层，用无水硫酸镁干燥，过滤，旋蒸除去乙酸乙酯得到红色固体4-氨基-3-硝基苯硫醇。将4-氨基-3-硝基苯硫醇（0.34 g，2 mmol）溶解在50%乙醇水溶液中（30 mL），然后将连二亚硫酸钠（1.40 g，8 mmol）在20 min 内分批加入，混合物回流反应1 h，冷却至室温后将混合物倾入100 mL 水中，用3×30 mL 的氯仿萃取，合并有机层，用无水硫酸镁干燥，过滤，旋蒸除去溶剂后得到粗产物，然后通过硅胶色谱法进行纯化（MeOH∶EA=1∶5），得到黄色固体，产率74%。1H NMR（400 MHz，DMSO-D4）δ8.09（d，J= 2.1 Hz，1H），7，59（s，2H），7.50（dd，J= 8.8，2.1 Hz，1H），6.98（d，J= 8.9 Hz，1H），3.17（s，1H）。MS（ES+）：C6H8N2S 的m/z计算值为140.04，［M+H］+实测值为141.10。1H NMR和MS（ES+）的结果表明所得产物为目标化合物DABT。

1.2.2 比率型SERS纳米探针AuNSs@Ag-DABT的制备与表征

AuNSs 按照文献所报道的晶体生长法进行制备［12］，然后将10 mL AuNSs 溶液置于反应瓶中，室温搅拌下，分别依次加入10 μL AgNO3溶液（0.1 mol/L）、抗坏血酸溶液（0.1 mol/L）和NH3·H2O 溶液（0.1 mol/L），溶液由蓝色变为紫色后，加入400 μL SDS溶液（0.1 mol/L）保持其稳定性，继续搅拌10 min后，通过4 500 r/min 离心10 min，重复离心3 次，收集得到的AuNSs@Ag 重悬于超纯水中。接着，将10 μL DABT乙醇溶液（1 mg/mL）与200 μL AuNSs@Ag溶液充分混匀，在25 ℃下避光反应2 h，随后5 000 r/min离心10 min，去除上清液，重复离心3 次，去除溶液中未结合的DABT 后得到AuNSs@Ag-DABT，并将其重悬于超纯水中。利用DLS、TEM、UV-Vis 和拉曼光谱等技术对制备的比率型纳米探针的粒径大小、形貌及光学性质等进行表征。

1.2.3 实验的可行性验证

DEA NONOate 是一种NO 供体，将其加入比率型SERS纳米探针中，缓慢产生NO，反应10 min后，利用拉曼光谱仪测量SERS纳米探针在633 nm激发光下的拉曼光谱，观察并比较拉曼峰值的变化。

1.2.4 实验条件的优化

1.2.4.1 SERS 基底的优化 取10 μL DABT 溶液（1 mg/mL），分别加入到200 μL 的AuNSs 溶液与AuNSs@Ag溶液中，反应2 h后，5 000 r/min离心10 min，弃上清，离心3次，重悬于200 μL超纯水中，混匀后利用拉曼光谱仪测量SERS纳米探针在633 nm下的拉曼光谱，观察拉曼特征峰值的变化。

1.2.4.2 SERS纳米探针上DABT浓度的优化 取DABT固体粉末，分别加入乙醇配制成不同质量浓度（0.5~2 mg/mL）的DABT 溶液，取各浓度的DABT 溶液10 μL 加入200 μL AuNSs@Ag 溶液中，在25 ℃下反应2 h，5 000 r/min 离心10 min，弃上清，离心3 次后加入200 μL 超纯水，混匀后利用拉曼光谱仪分别测量SERS 纳米探针在633 nm 激光下的拉曼光谱，记录拉曼特征峰值变化，对实验结果进行比较，所有实验结果均重复3次，选取最佳反应浓度。

1.2.4.3 AuNSs@Ag 与DABT 反应时间的优化 取6组200 μL AuNSs@Ag 溶液，加入10 μL DABT 溶液（1.5 mg/mL），分别在25 ℃反应3、2.5、2、1.5、1、0.5 h后，5 000 r/min离心10 min，弃上清，离心3次后加入200 μL超纯水，混匀后利用拉曼光谱仪分别测量SERS纳米探针在633 nm下的拉曼光谱，记录拉曼特征峰值的变化，所有实验结果均重复3次，对实验结果进行比较，选取最佳反应时间。

1.2.5 比率型纳米探针对NO的定量检测

取10 μL 不同浓度（10~100 nmol/L）的DEA NONOate 溶液，分别加入到6 组200 μL 的比率型纳米探针溶液，反应10 min 后，测量各组在633 nm 下的拉曼光谱强度，探究比率型SERS 纳米探针的检出限和检测范围。

1.2.6 比率型纳米探针的选择性及稳定性

使用6 种干扰物质：还原型（L-Cys、GSH）、氧化型（H2O2、NaClO）和同类分子型（NaNO3、NaNO2）评估比率型SERS纳米探针的选择性。取7组200 μL的比率型SERS纳米探针溶液，6组分别加入10 μL 20 μmol/L 的上述干扰试剂，最后一组加入10 μL 的DEA NONOate 溶液（2 μmol/L）作为对照组，反应10 min 后，比较各组在633 nm 下的激光拉曼光谱强度，探究比率型SERS 纳米探针的选择性。将纳米探针放置不同时间（1~7 d），然后和同一浓度的DEA NONOate 溶液（100 nmol/L）反应，通过比较各组在633 nm下的拉曼光谱强度，考察纳米探针的稳定性，所有实验均在3个平行样品中进行。

2 结果与讨论

2.1 纳米探针AuNSs@Ag-DABT的表征

利用TEM 考察不同纳米材料的形貌（如图2A）。结果显示，AuNSs 呈现典型的星状，表面尖锐突出，大小较均匀。经过修饰后形成的AuNSs@Ag-DABT 也呈星形（图2B），与初始状态的AuNSs的形态和大小均相似，AuNSs@Ag-DABT 的表面突起稍微变钝，以上表明修饰后纳米探针的形貌未产生明显变化。为探究经过每步修饰后纳米颗粒的水合粒径的变化情况及在水溶液中的分散情况，采用DLS 技术对不同的纳米材料进行分析（图2C），AuNSs、AuNSs@Ag 和AuNSs@Ag-DABT 的平均水合粒径分别为76、90、105 nm，AgNSs经过每步修饰后，平均水合粒径均略有增加。此外，AuNSs、AuNSs@Ag和AuNSs@Ag-DABT 3种纳米材料的分散性指数（PDI）分别为0.128、0.221、0.129，均小于0.3，表明其在水溶液中能够稳定存在，且具有良好的分散性。

图2 纳米材料的表征Fig.2 Characterization of nanomaterials

为进一步考察每步修饰之后纳米材料电荷性质的变化，用Zeta 电位检测仪分别测定了AuNSs、AuNSs@Ag 和AuNSs@Ag-DABT 的电势（图2D）。AuNSs 的电势约为-24 mV，形成核壳结构后的电势约为-31 mV，电负性增强，这是由于在制备核壳结构时使用SDS 溶液作为稳定剂，致使AuNSs@Ag 带有更多负电荷。进一步修饰DABT后纳米探针的电势约为-27 mV，电负性降低，这是由于DABT含有的两个—NH2可与水结合，并电离形成带有正电的—NH3+；当修饰DABT后，DABT的正电荷导致AuNSs@Ag-DABT 的电势上升。最后，通过酶标仪分别测定了3 种纳米材料的UV-Vis 吸收光谱（图2E），AuNSs 在720 nm处有较强的紫外吸收，而形成核壳结构后的AuNSs@Ag和AuNSs@Ag-DABT则在530 nm处产生特征吸收峰，且吸收峰明显蓝移，这是由于金核向银壳层发生了独特的电子转移所致［21］。

2.2 实验的可行性验证

通过拉曼光谱的变化，本实验探究了纳米探针AuNSs@Ag-DABT 用于检测NO 的可行性。DEA NONOate 作为一种外源性NO 供体可缓慢释放NO，AuNSs@Ag-DABT 中的DABT 可与NO 反应生成苯并三唑，并产生三唑环的拉曼特征峰。如图3A 所示，与NO 反应前，AuNSs@Ag-DABT 具有明显的拉曼信号。经NO 处理后，拉曼光谱在541 cm-1处出现一个新的拉曼峰，这是由于NO 和DABT 中的两个邻苯二氨基发生特异性反应，生成苯并三唑，导致光谱出现三唑环的拉曼特征峰。此外，NO 反应前后1 078 cm-1处的C—S离面弯曲拉曼峰的强度基本无变化。以上结果表明，AuNSs@Ag-DABT 纳米探针具有良好的NO响应能力，可以通过I541/I1078的变化实现NO的比率检测。

图3 AuNSs@Ag-DABT添加NO前后的拉曼光谱（A），AuNSs-DABT和AuNSs@Ag-DABT的拉曼光谱（B），AuNSs@Ag上DABT浓度（C）与反应时间（D）的优化Fig.3 Raman spectra of AuNSs@Ag-DABT before and after adding NO（A），Raman spectra of AuNSs-DABT and AuNSs@Ag-DABT（B） ，and optimization of concentration（C） and incubation time（D） of DABT on AuNSs@Ag

2.3 实验条件的优化

为提高AuNSs@Ag-DABT 对NO 的检测性能，对一系列关键实验条件进行优化。首先对SERS 基底进行筛选，分别制备了纳米探针AuNSs-DABT 和AuNSs@Ag-DABT，然后通过比较二者的拉曼光谱，探究其拉曼增强效应的强弱。结果如图3B 所示，与AuNSs-DABT 相比，AuNSs@Ag-DABT 的拉曼信号显著增强，表明AuNSs@Ag-DABT 具有更强的拉曼增强效应，因此选择AuNSs@Ag-DABT 作为SERS基底进行后续实验。DABT 在AuNSs@Ag 上的修饰量直接影响AuNSs@Ag-DABT 对NO 的检测性能，因此对DABT 在AuNSs@Ag 上的反应浓度以及反应时间进行优化。随着DABT 浓度的增加，AuNSs@Ag-DABT的拉曼信号强度逐渐增加，在DABT达到1.5 mg/mL时达到最大值，之后随着DABT浓度的增加，SERS纳米探针的拉曼信号强度逐渐下降（图3C）。表明DABT浓度过低会导致拉曼信号强度降低，而浓度过高时可能会导致AuNSs@Ag-DABT 聚集，同样使得拉曼信号强度降低，所以选择1.5 mg/mL 作为DABT 的最佳反应浓度。进一步优化DABT 的反应时间（图3D），可以观察到纳米探针的拉曼信号强度随着反应时间的增加而逐渐增强，在2 h时达到峰值，之后随着反应时间的变长，拉曼信号强度逐渐降低。这可能是由于反应时间过短时，只有少量DABT能结合到AuNSs@Ag上，导致AuNSs@Ag-DABT的拉曼信号强度较低；而反应时间过长时，则可能导致AuNSs@Ag-DABT 聚集，从而产生较低的拉曼信号。因此，实验选择2 h作为DABT的最佳反应时间。

2.4 纳米探针对NO的定量检测

为探究SERS 纳米探针对NO 的动态响应范围，在最优实验条件下制备比率型SERS 纳米探针AuNSs@Ag-DABT，然后分别与不同浓度（1~100 nmol/L）的DEA NONOate 反应，并在633 nm 下测定其拉曼光谱，根据拉曼信号强度与NO 浓度的关系分别绘制信号强度变化曲线及检测线性曲线。如图4A所示，随着NO 浓度的增加，其在541 cm-1处的拉曼强度也逐渐增强，而在1 078 cm-1处的拉曼信号强度基本保持不变，二者的比率I541/I1078也不断增大，证明比率型SERS 纳米探针对NO 具有良好的响应。在10~60 nmol/L的动态范围内，NO的浓度与I541/I1078之间具有一定的线性关系（如图4B所示），线性回归方程为y=0.001 84x+0.005 81（r2 =0.998 6），其中y为I541/I1078，x为NO 的浓度。根据线性方程，计算得到检出限（LOD）为3.89 nmol/L，LOD = 3σ/k，其中σ为空白测量值（n=3）的标准偏差（SD），k为线性方程的斜率。

图4 AuNSs@Ag-DABT与不同浓度NO反应的拉曼光谱（A） 以及I541/I1078与NO浓度间的线性关系（B）Fig.4 Raman spectra of AuNSs@Ag-DABT at different concentrations of NO（A） and linear relationship of NO concentration and I541/I1078（B）concentrations of NO（a-f）：10，20，30，40，50，60 nmol/L

2.5 纳米探针的选择性与稳定性

本文使用6 种干扰物质：可以还原NO 的物质（L-Cys、GSH）、可以氧化NO 的物质（H2O2、NaClO）和NO 的同类型分子（NaNO3、NaNO2）评估比率型SERS 纳米探针的选择性。将NO 和干扰物质分别反应（NO 的浓度为2 μmol/L，干扰物质的浓度为20 μmol/L），然后在633 nm 下测定其拉曼光谱。从图5 可以看出，与NO 反应后，纳米探针的比率峰（I541/I1078）的数值最大，而与干扰物质反应后，I541/I1078的数值较小，这表明比率型SERS 纳米探针能够特异性识别NO，而对其他干扰物质几乎不响应。进一步考察SERS纳米探针的稳定性，将纳米探针放置不同时间（1~7 d）后，分别与NO反应，测定其拉曼信号比值的变化。结果显示，放置不同时间的纳米探针的I541/I1078的数值无明显变化（如图5 插图），表明该SERS纳米探针具有良好的稳定性。

图5 比率型SERS纳米探针的选择性Fig.5 Selectivity of the ratiometric SERS nanoprobe insert：the stability of the nanoprobe

本研究与报道的其他检测NO 的方法性能进行比较，结果如表1 所示。与其他NO 探针相比，该探针具有较低的检出限。更重要的是，该探针采用比率模式进行检测，大大降低了背景干扰且具有较高的特异性与稳定性，从而使检测结果更可靠。

表1 本方法与其他NO检测方法的比较Table 1 Comparison of the approach in this work and the relevant methods for detection of NO

3 结 论

本文构建了一种基于SERS 的比率型纳米探针用于快速、灵敏地检测NO。当存在NO 时，纳米探针AuNSs@Ag-DABT 上的DABT 可以特异性地与NO 发生反应生成苯并三唑，并在541 cm-1处产生一个新的三唑环拉曼特征峰，而在1 078 cm-1处的C—S 离面弯曲特征峰的拉曼强度不变，基于此可实现对NO的比率型SERS检测。在最优实验条件下，纳米探针对NO的线性响应范围为10~60 nmol/L，检出限为3.89 nmol/L。该纳米探针具有较高的选择性和良好的稳定性。这种新型比率型SERS 纳米探针有望作为NO水平异常引起的疾病的基础研究和临床诊断的新工具。