珠蛋白水解物对肌球蛋白大豆油乳液理化性质的影响

李亚凯, 周存六, 李 锐, 潘冬梅, 周 辉, 徐宝才

(合肥工业大学 食品与生物工程学院,安徽 合肥 230601)

0 引 言

血红蛋白是一种低廉的蛋白质资源,约占血液总蛋白质质量分数的80%。血红蛋白含有约4%的血红素,它导致血红蛋白腥味和不良色泽,限制了血红蛋白在食品工业中的应用[1]。脱血红素对于血红蛋白的使用很有必要。

目前为止,已开发一系列血红蛋白脱血红素的方法。文献[2]在pH值为4的酸性条件下使用丙酮溶液(80%)分离血红素铁,但存在成本高、有机溶剂耗损高等缺点;文献[3]在pH值为3.0条件下用羧甲基淀粉钠吸附血红素的方法去除血红素铁,但效果有限;文献[4]用过氧化氢水溶液氧化血红素铁进行脱色,但存在过氧化氢残留等缺点。表面活性剂已被证明可有效分离血红素铁和珠蛋白[5],有工艺简单、成本低和效率高等优点。

因溶解度、凝胶性和乳化性差,珠蛋白难以直接用于食品加工。文献[6]采用羧甲基纤维素法从牛血红蛋白制备的珠蛋白溶解度低、乳化能力差。因此,珠蛋白分子在使用前必须进行修饰以改善其功能特性。酶水解被认为是提高蛋白质溶解性等功能性质的有效方法。研究证明玉米醇溶蛋白水解物可改善肌原纤维蛋白基水包油乳液的乳化和氧化稳定性[7]。在中性条件下,添加9%大豆肽的蛋清粉具有最佳发泡性能[8]。添加超过20 g/kg的猪血浆水解物可抑制微生物的生长,并改善乳化香肠的质地[9]。因此,以蛋白质水解物改善食品品质引起了学者的广泛兴趣。然而,关于珠蛋白水解物在食品制造中应用的相关报道很少。肌球蛋白具有乳化和凝胶等性质,对最终产品的保水、保油和质构等品质属性具有决定性影响[10]。珠蛋白水解物是血球蛋白粉通过脱色和酶解工艺处理得到的产物。因此,本文通过比较血球蛋白粉、珠蛋白和珠蛋白水解物对肌球蛋白大豆油乳液理化性质的影响,研究脱色和酶解对血球蛋白粉理化性质的影响,为血球蛋白粉在食品工业中的应用奠定基础。研究结果将为畜禽血液的深加工提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 材料与设备

1.1.1 材料

血球蛋白粉(三元龙胜有限公司);大豆油(合家福超市);表面活性剂(国药集团化学试剂有限公司);胃蛋白酶(10 000 U/g)(宏润宝顺科技有限公司);其他试剂均为分析纯。

从大润发超市购买4批新鲜猪后腿肉。在去除所有肉眼可见的结缔组织和脂肪后,将猪后腿肉切成块状(约2 cm×2 cm×2 cm),并用食物切碎机切碎2次(每次1 min)。

1.1.2 设备

GL-21M型高速冷冻离心机(湘仪仪器开发有限公司);WTC10002型电子天平(杭州万特衡仪器有限公司);PHS-3E型pH计(上海仪电科学仪器股份有限公司);HH-54型水浴锅(金坛市医疗仪器厂);K9840型凯氏定氮仪(海能科学仪器有限公司);PD500型高速剪切乳化机(PRIMA(德国));TCS SP8型激光共聚焦显微镜(徕卡(德国)照相机有限公司)。

1.2 实验方案

1.2.1 珠蛋白的制备

根据文献[5]的方法制备珠蛋白,向血球蛋白粉溶液(7.6 g血球蛋白粉溶于300 mL蒸馏水)中加入100 mL 质量分数为4%的表面活性剂溶液,使用12 mol/L盐酸将混合物的pH值调至1.5,然后将混合物水浴从40 ℃加热至80 ℃。在混合物颜色从红色变为紫色并且其上层出现白色泡沫后,继续将混合物加热5 min,然后冷却至室温。在13 000g离心15 min后,用10 mol/L氢氧化钠溶液将上清液的pH值调节至7.0。将上清液在4 450g下离心15 min,用400目尼龙滤网收集沉淀物(珠蛋白),并用蒸馏水润洗2次,然后在气压小于10 Pa下冷冻干燥24 h。收集干燥的沉淀物即为珠蛋白。

1.2.2 珠蛋白水解物的制备

由1.2.1获得的珠蛋白被用于制备珠蛋白水解物,向珠蛋白溶液(20 mg/mL)加入250 U/g的胃蛋白酶,用浓盐酸将pH值调至1.5,37 ℃下孵育1 h后使用10 mol/L氢氧化钠将pH值调节至7.0;然后将混合物在沸水中加热10 min以使酶失活。在11 300g离心15 min后收集上清液,并在气压小于10 Pa下冷冻干燥24 h。珠蛋白水解物在4 ℃条件下保存待用。

1.2.3 大豆油预处理

根据文献[11]的方法去除大豆油中的生育酚,大豆油和氧化铝(质量比2∶1)混合并避光搅拌24 h,离心(4 000g,10 min)后去除沉淀。收集处理后的大豆油备用。

1.2.4 肌球蛋白提取

按照文献[10]的方法提取肌球蛋白,使用双缩脲法测定提取的肌球蛋白浓度,并用PBS缓冲液(0.6 mol/L KCl、10 mmol/L 磷酸钾溶液, pH值 6.5)将肌球蛋白稀释到8 mg/mL并在4 ℃下储存,48 h内使用完。

1.2.5 肌球蛋白大豆油乳液的制备

按照文献[10]的方法制备肌球蛋白大豆油乳液。将48 g肌球蛋白和12 g大豆油的混合物在10 000 r/min下均质2 min,分别将质量分数为0.08%的血球蛋白粉、珠蛋白、珠蛋白水解物与48 g肌球蛋白充分混合并在相同条件下均质,依次命名为乳液1～乳液4。向乳液中添加叠氮化钠(0.2 mg/mL)以防止微生物繁殖。所有乳液在25 ℃条件下储藏。

1.2.6 溶解度的测定

血球蛋白粉、珠蛋白或珠蛋白水解物溶解度根据文献[12]的方法进行测定。血球蛋白粉、珠蛋白或珠蛋白水解物(20 g/L)溶解在100 mL的PBS缓冲液中,充分搅拌混匀后在10 000g离心20 min,然后将沉淀冷冻干燥并称重。使用凯氏定氮仪测定血球蛋白粉、珠蛋白、珠蛋白水解物及其各自在PBS缓冲液中沉淀物的蛋白质质量分数。并计算其溶解度,具体公式如下:

溶解度=[(m0w0-m1w1)/(m0w0)]×100%,

其中:m0为血球蛋白粉、珠蛋白或珠蛋白水解物的初始质量;m1为冻干后沉淀的质量;w0为血红蛋白粉、珠蛋白或珠蛋白水解物中蛋白质的质量分数;w1为冻干后沉淀中蛋白质质量分数。

1.2.7 铁离子质量比测定

根据GB 5009.268—2016[13]测定血球蛋白粉、珠蛋白和珠蛋白水解物中铁离子质量比。

1.2.8 分层指数及乳化性质测定

分层指数根据文献[14]的方法测定。

按照文献[11]的方法测定乳化活力指数(emulsification activity index,EAI)和乳化稳定性指数(emulsion stability index,ESI)。

1.2.9 乳液粒径分布及体积平均粒径

根据文献[14]的方法使用百特激光粒度仪测定乳液第1、3、5天的粒径分布和体积平均粒径(D4,3)。

1.2.10 显微结构的测定

根据文献[15]的方法,在第1、3、5天观察乳液的光学显微镜图像。用等体积PBS缓冲液稀释乳液,稀释后的乳液(50 μL)滴在载玻片上并用盖玻片压紧,以确保没有气泡。在物镜下观察样品,每个样品随机观察至少3个不同的位置。

在第1、3、5天,使用激光扫描共聚焦显微镜(confocal laser scanning microscope,CLSM)观察乳液中的油和蛋白质分布[14]。在每种情况下随机捕获至少3个不同的位置。

1.2.11 脂质氧化的测定

采用文献[11]方法测量乳液在室温下1、3、5 d的过氧化值;使用分光光度法测定乳液在室温下1、3、5 d的硫代巴比妥酸值[11]。

1.2.12 数据分析

所有实验均重复3次,结果以(平均值±标准差)表示。使用SPSS 25.0 软件对所有数据进行方差分析(ANOVA)评估。不同大写字母(A～C)表示相同处理下、不同储存时间下的结果有显著性差异;不同小写字母(a～d)表示在相同储存时间、不同处理下的结果有显著性差异;P<0.05表示有显著差异,P>0.05表示无显著性差异。

2 结果与分析

2.1 溶解度和铁离子质量比分析

2.1.1 溶解度

溶解度与蛋白质的功能特性密切相关,如凝胶和乳化性。血球蛋白粉、珠蛋白和珠蛋白水解物的溶解度见表1所列,从表1可以看出,珠蛋白在PBS缓冲液中的溶解度(1.07%)明显低于血球蛋白粉(74.44%)(P<0.05)。这可能是由于珠蛋白制备过程中在强酸和加热条件下发生变性(更多的疏水基团暴露)[16]。此外,PBS缓冲液的pH值接近珠蛋白的等电点(pI≈7.0)[6],这也是珠蛋白溶解度较低的原因。溶解度低的蛋白质通常具有较差的乳化和胶凝性能。因此,使用胃蛋白酶水解珠蛋白以提高溶解度。珠蛋白水解物在PBS缓冲液中的溶解度达到95.80%。文献[8]的研究发现,从牛血中提取的珠蛋白的溶解度在经过胃蛋白酶限制性水解后显著提高。

表1 血球蛋白粉、珠蛋白及其水解物的溶解度和铁离子质量比

2.1.2 铁离子质量比

铁离子能够催化蛋白质和脂质的氧化。脂质氧化易导致食品质量降低、保质期缩短,并生成有害物质,如醛类和酮类物质。此外,蛋白质氧化可导致结构变化和功能特性降低[17](如凝胶性和乳化性)。因此,最大限度地去除血红素铁,对于拓展血红蛋白在食品工业中的应用至关重要。

血球蛋白粉、珠蛋白和珠蛋白水解物的铁离子质量比见表1所列。由表1可知,血球蛋白粉、珠蛋白和珠蛋白水解物中的铁离子质量比分别为2 210.0、385.5、2.6 mg/kg。结果表明:在珠蛋白制备过程中,血球蛋白粉中约82.56%的铁离子被去除。这可能归因于在酸性、加热和表面活性剂共同作用下,血红蛋白中大多数血红素分离和沉淀[6];在酶水解期间,珠蛋白中约99.32%的铁离子被去除,这可能归因于酶水解期间珠蛋白中残余血红素的释放[18]。珠蛋白制备和酶水解过程中铁离子质量比的降低可能对扩大血红蛋白及其衍生物在食品工业和其他领域的利用具有重要意义。

2.2 分层指数分析

分层指数用于反映储存期间乳液的物理稳定性。不同处理对肌球蛋白大豆油乳液分层指数的影响如图1所示。由图1可知,随着储存时间延长,所有样品中的分层指数增加,这可能归因于肌球蛋白大豆油乳液的热力学不稳定性[14]。乳液2的分层指数在120 h下降到30.13%,表明血红蛋白可显著提高肌球蛋白大豆油乳液的物理稳定性。此外,文献[18]报道血红蛋白可以作为乳化剂,吸附在大豆油水界面上。乳液3在储存期间的分层指数略高于乳液1(P>0.05),表明珠蛋白不能有效影响肌球蛋白大豆油乳液的物理稳定性,这可能与珠蛋白溶解度差有关。如上所述,乳化性能是蛋白质的重要功能特性。目前的研究表明,珠蛋白不适合用于食品加工。在所有乳液中,乳液4在120 h时具有最低分层指数(16.96%),表明珠蛋白水解物在改善肌球蛋白大豆油乳液的物理稳定性方面比血球蛋白粉更有效。文献[7]的研究发现玉米醇溶蛋白水解物降低了肌原纤维蛋白制备的水包油乳液的分层指数,并提高EAI和ESI。文献[19]的研究发现玉米蛋白水解物能够提高基于大豆分离蛋白的O/W乳液的蛋白质覆盖率。上述文献推测,由于玉米蛋白水解物与大豆分离蛋白、玉米醇溶蛋白水解物与肌原纤维蛋白之间的非共价相互作用,使得玉米蛋白水解产物、玉米醇溶蛋白水解物吸附到油水界面,并增加界面蛋白的覆盖率。因此,珠蛋白水解物可能吸附在大豆油水界面上,并增加界面蛋白的覆盖率,从而在当前条件下降低分层指数。本文研究结果表明,血红蛋白及其水解物均能有效改善肌球蛋白大豆油乳液的物理稳定性,在乳化食品生产中具有一定潜力。

图1 不同处理对肌球蛋白大豆油乳液分层指数的的影响

2.3 乳化性质分析

EAI反映蛋白质快速结合液滴界面的能力,ESI反映蛋白质在一段时间内保持乳液稳定的能力[20]。为了评估新制备乳液的物理稳定性,本研究测定了EAI和ESI。

不同处理对肌球蛋白大豆油乳液的EAI和ESI影响如图2所示。从图2a可以看出:乳液2的EAI略高于乳液1(P>0.05),表明血球蛋白粉不能有效影响肌球蛋白大豆油乳液的EAI;考虑到乳液2中加入血球蛋白粉的量相当于肌球蛋白的10%以及EAI的定义,可以推测血红蛋白被吸收至大豆油水界面且展开;乳液3的EAI最低(17.85 m2/g),表明珠蛋白在大豆油水界面既不吸附也不展开,这可能与珠蛋白的溶解度差和刚性结构密切相关[6];乳液4具有最高的EAI(25.98 m2/g),表明珠蛋白水解物增强了肌球蛋白大豆油乳液的EAI。文献[19]的研究发现,玉米蛋白水解物通过非共价相互作用导致更多大豆分离蛋白吸附到界面上。文献[21]提出肽可以通过非共价相互作用与蛋白质特异性结合,这些作用改变蛋白质肽系统的凝胶、乳化和其他功能特性。因此,珠蛋白水解物能导致更多的肌球蛋白吸附在大豆油水界面上,并提高肌球蛋白的EAI。另外,文献[22]发现碱性蛋白酶水解使得绿豆蛋白结构从刚性转化为柔性。珠蛋白经胃蛋白酶水解后结构可能由刚性转化为柔性,方便其吸附至大豆油水界面上并导致覆盖率的增加,即有更高的EAI。

图2 不同处理对肌球蛋白大豆油乳液乳化性质的影响

由图2b可知,不同乳液之间的ESI差异与分层指数中的差异一致。

2.4 乳液粒径分布和体积平均粒径(D4,3)分析

乳液的粒径分布和体积平均粒径(D4,3)通常用于反映乳液的物理稳定性。不同处理对肌球蛋白大豆油乳液粒径分布的影响结果如图3所示。

图3 不同处理对肌球蛋白大豆油乳液粒径分布的影响

由图3可知,乳液液滴尺寸主要分布在4～400 μm的范围内,且随着储藏时间的延长所有乳液的粒径均向较大颗粒尺寸的方向移动,表明发生了液滴的絮凝和聚集。这可能是肌球蛋白大豆油乳液的热力学不稳定性导致的。

由图3可知,乳液3的分布峰与乳液1的分布峰相似;与乳液1相比,乳液2和乳液4的分布峰均向较小尺寸的方向移动,后者的移动更为显著。为了定量描述不同乳液在储存过程中的变化,使用激光粒度分布分析软件(Ver 6.0)进一步计算它们的体积平均粒径,结果见表2所列。由表2可知,乳液3和乳液1的D4,3在整个储存过程中显著增加(P<0.05),而乳液2和乳液4的D4,3在最初3 d显著增加(P<0.05),但在接下来的2 d内没有显著变化(P>0.05)。结果表明:珠蛋白对乳液液滴粒径的影响较小;血球蛋白粉和珠蛋白水解物均显著降低乳液液滴粒径,且珠蛋白水解物比血球蛋白粉更有效。乳液液滴粒径的增加与其在储存期间的聚集和絮凝密切相关。

表2 不同处理对肌球蛋白大豆油乳液D4,3的影响

因此,本研究结果表明,血球蛋白粉和珠蛋白水解物都有效抑制了乳液中液滴的絮凝和聚集,且珠蛋白水解物的效果优于血球蛋白粉。这可能与珠蛋白水解物可以增加肌球蛋白大豆油乳液界面的蛋白质覆盖率有关。文献[7]的研究发现玉米醇溶蛋白水解物降低了肌原纤维蛋白制备的水包油乳液的D4,3。该结果与上述EAI、ESI和分层指数的结论一致。

2.5 乳液微观结构分析

使用40倍CLSM物镜和20倍光学显微镜观察乳液的微观结构。不同处理对乳液微观结构的影响如图4所示。

图4 不同处理对肌球蛋白大豆油乳液微观结构的影响

通过CLSM可以直观地观察乳液中的蛋白质(红色)和油滴(绿色)。

由图4a可知,在所有样品中,随着储存时间的延长,液滴变得更大。在相同的储存时间时,乳液1和乳液3中发现了严重的絮凝和聚集,而乳液2和乳液4在储存过程中发现了轻微的絮凝和聚集。此外,与乳液2和乳液4相比,絮凝和聚集明显受到抑制。这与D4,3一致,并为不同处理引起的肌球蛋白大豆油乳液的物理稳定性(分层指数、EAI和ESI)差异提供了合理的解释。由图4b可知,使用光学显微镜也观察到类似的现象。由于絮凝和聚集,空白组中观察到大液滴;血球蛋白粉和珠蛋白水解物抑制肌球蛋白大豆油乳液在储存过程中的絮凝和聚集,且珠蛋白水解物更有效;然而,珠蛋白很少有效。珠蛋白水解物处理使液滴很少絮凝,更加均匀。这些结果与上述分层指数、ESI和D4,3的结果一致。

2.6 脂质氧化分析

脂质氧化程度被认为是反映乳液化学稳定性的重要指标之一,与食品风味和可接受性密切相关[23]。过氧化物和硫代巴比妥酸是脂质氧化的一级和二级产物。因此,在第1、3、5天测定了肌球蛋白大豆油乳液中过氧化值和硫代巴比妥酸值。

不同处理对肌球蛋白大豆油乳液脂质氧化的影响如图5所示。由图5可知,随着储存时间的延长,所有乳液的过氧化值和硫代巴比妥酸值均显著增加(P<0.05)。在相同的储存时间内,过氧化值从大到小依次为乳液2、乳液3、乳液4、乳液1,不同乳液之间的过氧化值差异显著(P<0.05),特别是乳液2与乳液3和乳液4之间。与未经任何处理的肌球蛋白大豆油乳液相比,在第1天,用珠蛋白或血球蛋白粉处理的乳液中的硫代巴比妥酸值显著高于空白组(P<0.05),用珠蛋白水解物处理的乳液略高于空白组(P>0.05);然而,在第3天和第5天不同乳液之间的过氧化值的差异与硫代巴比妥酸值的差异相似。结果表明,血球蛋白粉、珠蛋白和珠蛋白水解物都能够加速脂质氧化,其能力从高到低依次为血球蛋白粉、珠蛋白、珠蛋白水解物。铁离子是一种重要的促氧化剂,能够催化脂质氧化[24]。因此,目前的结果可能与血球蛋白粉、珠蛋白和珠蛋白水解物中的铁离子质量比有关。血球蛋白粉、珠蛋白和珠蛋白水解物的铁离子质量比分别为2 210.0、385.5、2.6 mg/kg。铁离子质量比越低,促进脂质氧化程度越小。

图5 不同处理对肌球蛋白大豆油乳液脂质氧化的影响

如前所述,脂质氧化通常导致营养物质损失、不良气味,甚至形成有害物质,对食品质量和安全造成不利影响。因此,血球蛋白粉、珠蛋白和珠蛋白水解物在食品制造中的应用可能受到限制。然而,与血球蛋白粉相比,珠蛋白尤其是珠蛋白水解物加速脂质氧化的能力非常弱,这与它们中铁离子含量有关。结果表明,通过去除血球蛋白粉及其衍生物中铁离子可以在很大程度上降低脂质氧化的程度,对畜禽血液的综合利用有一定的实际意义。

3 结 论

与血球蛋白粉和珠蛋白相比,珠蛋白水解物在增强肌球蛋白大豆油乳液的物理稳定性方面更有效,并且显示出较弱的促进氧化特性。结果表明,通过去除血红素铁和酶水解可以改善血球蛋白粉的乳化性能,并显著抑制其促进氧化能力,在食品工业中的应用具有一定潜力。本研究为畜禽血液的综合利用提供了依据。