香菇培养料的双螺杆挤压灭菌工艺优化

魏书信，王安建，高帅平，田广瑞，刘丽娜，许方方，李顺峰，崔国梅

（河南省农业科学院农副产品加工研究中心，河南 郑州 450002）

香菇是世界第二大食用菌，约占全球食用菌总产量的25%，是我国总产量最高的食用菌[1-2]。香菇生产目前大部分都采用熟料袋栽培即菌棒栽培模式[3-4]，加工工序基本都为先装袋再常压或高压蒸汽杀菌，这2种灭菌方式都存在需要锅炉供热、灭菌料易发酵、环境污染大、耗时、耗工和经常灭菌不彻底的问题，且都面临着环保禁煤炭后的能源变革引起的成本急升的问题[5-6]。培养料新型灭菌设备及技术研发升级已成为香菇乃至整个食用菌产业亟需解决的关键问题。

目前，科研工作者针对食用菌培养料的高效灭菌进行了许多探索研究，但大都集中在煤替代清洁能源、蒸汽间歇式灭菌新设备新技术等传统锅炉蒸汽灭菌改进研究上，包括采用微波灭菌等新技术研究在内，几乎全都采用罐体内密闭间歇灭菌、分批次输出的工艺[5-7]，连续式瞬时灭菌研究鲜有报道。

双螺杆挤压加工是一种集剪切、搅拌、混合、加热、均质于一体的加工技术，广泛应用于组织化蛋白加工、膳食纤维生产、休闲膨化食品生产、食品浸油等加工领域，具有生产连续、工艺简单、能耗低、成本低、绿色加工等优点[8-10]。双螺杆挤压机可设置阶段性高温区，因而兼具灭菌功能。香菇培养料以木屑、谷物皮壳为主要原料，富含木质纤维素，而木质纤维素只有在被分解成小分子物质后才能被香菇吸收利用[11-13]，螺杆挤压固有的剪切及膨化特性能将一部分木质纤维素降解为小分子物质从而更有利于香菇的吸收利用。双螺杆挤压加工与传统蒸汽灭菌相比具有灭菌供能过程零排放、不使用锅炉压力容器、灭菌灌装连续一体完成、节省工序和人工等优点。因此，将双螺杆挤压应用于香菇培养料灭菌具有理论可行性和经济价值。为明确挤压灭菌应采用何种加工工艺参数、挤压灭菌后物料性状的改变情况，在双螺杆挤压灭菌设备创制以适应挤压灭菌香菇培养料的基础上，针对香菇菌包发菌、转色、出菇的影响等未知问题，以香菇培养料的灭菌率为指标，通过Plackett-Burman 试验、最陡爬坡试验和响应面优化试验对香菇培养料的双螺杆挤压灭菌工艺进行优化，并以传统蒸汽灭菌为对照进行栽培试验，以期为双螺杆挤压在香菇培养料连续瞬时灭菌中的应用奠定基础。

1 材料和方法

1.1 材料与试剂

木屑、石膏、生石灰由西峡县孙氏菌业专业合作社提供；麸皮购自新乡市明阳面粉厂；平板计数琼脂购自北京奥博星生物技术有限责任公司；氯化钠由国药集团化学试剂有限公司生产；香菇L808栽培种由河南驻马店市农科院提供。

1.2 主要仪器

双螺杆挤压灭菌设备由河南省农业科学院农副产品加工研究中心设计定制；VS-1300L-U 洁净工作台由苏州安泰空气技术有限公司生产；THZ-98AB 恒温振荡器、BPMJ-250F 霉菌培养箱由上海一恒科学仪器有限公司生产；GSP-230 隔水式恒温培养箱由天津市来玻特瑞仪器设备有限公司生产。

1.3 方法

1.3.1 香菇培养料配制 香菇培养料的配方为木屑78%、麸皮20%、石膏1%、生石灰1%、含水量55%。先木屑定量加水并搅拌润湿一定时间，再加入其他辅料搅拌均匀，配成一定含水量的香菇培养料。

1.3.2 Plackett-Burman 试验 应用Minitab 17 软件进行Plackett-Burman 试验设计，以灭菌率为考核指标，对影响灭菌的木屑润水时间、原料初始含水量、Ⅰ区温度、Ⅱ区温度、Ⅲ区温度、Ⅳ区温度、喂料电机频率、螺杆电机频率共8 个因素通过2 水平试验进行显著影响因素筛选[14-16]。试验设计因素水平见表1。

表1 Plackett-Burman 试验因素与水平Tab.1 Factors and levels used in Plackett-Burman design

1.3.3 最陡爬坡试验 通过Plackett-Burman 试验结果分析，筛选出对双螺杆挤压灭菌率有显著影响的3个因素，设计最陡爬坡试验，因素爬坡方向由效应值的正负确定，因素步长根据效应值大小结合实际情况设计。其他因素水平依据试验结果各因素的效应正负进行确定，正效应取高值而负效应取低值[17]。以灭菌率为指标确定因素最佳组合。

1.3.4 响应面优化试验 利用Design-Expert V8.0.6 软件设计Box-Behnken 响应面试验，以最陡爬坡试验最佳组合水平为响应面因素0 水平，以灭菌率为响应值，进行响应面工艺优化试验设计，建立响应面数学模型，分析、预测出香菇培养料挤压灭菌最佳工艺条件，再结合仪器的精确度和操作便利性进一步优化工艺[18]，并对优化工艺进行试验验证。

1.3.5 灭菌效果评判 灭菌效果以灭菌后单位质量物料的菌落总数进行评判。在双螺杆挤出机出料口无菌取样进行菌落总数测定。从挤压机出料口开始出料即开始取样，每3 min 用无菌取样杯接取1 个样，每组试验机器运行30 min 取10 个灭菌样，试验样菌落数取10 个样的平均数；同批次未灭菌的香菇培养料用无菌取样杯取3个样检测菌落总数，3个样的平均菌落总数即为原料样初始菌落数。

菌落总数检测标准参照GB 4789.2—2016 中的方法[19]。根据检测结果计算灭菌率，灭菌率计算公式如下。

灭菌率=[（原料样初始菌落数-试验样菌落数）÷原料样初始菌落数）]×100%。

1.3.6 香菇栽培试验 按照1.3.1 配方和1.3.4 优化确定的最佳挤压灭菌工艺制备双螺杆挤压灭菌香菇栽培袋，灌装袋规格为17 cm×55 cm×0.007 cm，常规方法接种香菇L808 进行栽培试验。以相同配方按照传统蒸汽灭菌方法（115 ℃灭菌3 h，灭菌全过程8 h）制备香菇栽培袋为对照，考察香菇栽培袋质量、菌棒出菇特性、坏袋率等指标。

1.4 数据处理

利用Design-Expert V8.0.6 和Minitab 17 进行试验设计分析；除特别说明外，试验均为3次重复取平均值；响应面试验灭菌率保留2位小数，其他试验灭菌率均保留1位小数。

2 结果与分析

2.1 Plackett-Burman 试验设计及结果

Plackett-Burman 试验设计与结果见表2。从方差分析结果（表3）可知，模型P=0.048＜0.05，建模成功。由P值大小得到各因素对灭菌率的影响大小为原料初始含水量＞喂料电机频率＞Ⅲ区温度＞Ⅰ区温度＞Ⅳ区温度＞木屑润水时间＞螺杆电机频率＞Ⅱ区温度。其中原料初始含水量、喂料电机频率、Ⅲ区温度3 个因素对灭菌率的影响显著，需进一步做最陡爬坡试验。由T值可知，喂料电机频率对灭菌率呈负效应，其他7个因素均呈正效应。

表2 Plackett-Burman试验设计与结果Tab.2 Experimental design and results of Plackett-Burman

表3 Plackett-Burman 试验结果分析Tab.3 Statistical analysis of Plackett-Burman design

2.2 最陡爬坡试验设计及结果

利用3 个显著因素原料初始含水量、喂料电机频率、Ⅲ区温度做最陡爬坡试验。其他5 因素水平按照效应正值取高数负值取低数的原则，固定为木屑润水时间3 h、Ⅰ区温度90 ℃、Ⅱ区温度140 ℃、Ⅳ区温度130 ℃、螺杆电机频率21 Hz。由表4 可知，第4组灭菌率为92.8%最高，第4组为最佳组合，以该组因素水平为0值设计响应面优化试验。

表4 最陡爬坡试验设计及结果Tab.4 Experimental design and results of steepest ascent

2.3 响应面优化试验设计及结果

2.3.1 Box-Behnken 试验设计结果与分析 以原料初始含水量、喂料电机频率、Ⅲ区温度为响应因子，灭菌率为响应值，试验设计与结果见表5，二次模型方差分析见表6。经回归分析，得到灭菌率（Y）对原料初始含水量（A）、喂料电机频率（B）、Ⅲ区温度（C）的二次回归模型方程。

表5 Box-Behnken 试验设计与结果Tab.5 Experimental design and results of Box-Behnken

表6 响应面二次模型方差分析Tab.6 ANOVA for response surface quadratic model

Y=97.45-6.85A-1.71B+3.21C+3.93AB-0.85AC+6.03BC-7.99A2-7.28B2-3.38C2。

模型P=0.000 4（P＜0.01），极显著；一次项A、交互项BC、二次项A2和B2对灭菌率的影响极显著（P＜0.01）；一次项C、交互项AB、二次项C2对灭菌率的影响显著（P＜0.05）；失拟项P=0.086 2（P＞0.05），不显著，说明该方程试验误差小，拟合度较好；R2=0.960 6＞0.9，说明模型的拟合度较好，=0.910 0，表明利用该模型能解释91.00%响应值的变化，说明该模型能用于香菇培养料双螺杆挤压灭菌工艺的灭菌率理论预测。

2.3.2 响应面分析 Box-Behnken 试验响应面和等高线图见图1。响应面和等高线图可以较直观地看出各因素水平与响应值间的关系趋势以及两因素间交互作用对响应值的影响[20-21]。从图1可以看出，原料初始含水量和喂料电机频率等高线图椭圆程度较高，响应面图坡度陡峭，说明原料初始含水量和喂料电机频率对灭菌率的交互作用显著，分析原因可能是原料含水量显著影响原料的软硬度，螺杆电机频率影响物料在螺杆中的搅拌翻滚前进速度，两者共同作用显著影响原料输送过程的摩擦挤压自发热和吸收外热的程度，进而影响灭菌率；原料初始含水量与Ⅲ区温度响应曲面图坡度较平缓，等高线图近圆形，表明原料初始含水量与Ⅲ区温度对灭菌率的交互作用不显著；喂料电机频率与Ⅲ区温度响应曲面图坡度较陡且其等高线图椭圆形程度很高，说明喂料电机频率与Ⅲ区温度对灭菌率的交互作用显著，其原因可能是喂料电机频率决定螺杆挤压的喂料饱和度，进而影响原料堆积推进速度即影响物料通过Ⅲ区的时间长短，而Ⅲ区温度监测的实际是料仓外壁温度，物料通过Ⅲ区的时间长短能直接影响Ⅲ区仓壁温度与原料的热传导时长，进而影响杀菌温度和最终的灭菌率。

图1 各因素交互作用对灭菌率影响的响应面图与等高线图Fig.1 Response surface plots and contour plots showing the interactive effect of various factors on sterilization rate

依据响应面法建立的数学方程模型，预测分析出香菇培养料双螺杆挤压灭菌工艺的最佳工艺条件：原料初始含水量48.61%，喂料电机频率26.96 Hz，Ⅲ区温度162.51 ℃，灭菌率预测值为99.878 9%。

结合仪器的精确度和方便操作性，将最佳工艺条件修改：原料初始含水量48.6%，喂料电机频率27 Hz，Ⅲ区温度162 ℃。在此工艺条件下做3 批次灭菌验证试验，香菇培养料平均灭菌率为99.92%，与预测值比较接近，说明新建模型能较好地预测香菇培养料双螺杆挤压灭菌工艺的灭菌率，表明响应面法优化香菇培养料双螺杆挤压灭菌工艺是可行的。

2.4 香菇栽培试验结果

由表7 可知，双螺杆挤压灭菌生产的香菇栽培袋质量、菌丝体满袋天数、转色天数与对照传统蒸汽灭菌相比均无显著变化，菌棒可以正常出菇、菇型良好，香菇单菇质量显著增加，香菇菌盖直径显著增加、厚度增加但不显著，香菇菇柄直径无显著降低、菇柄长度显著增加，菌袋的坏袋率显著降低。

表7 香菇栽培试验差异性分析Tab.7 Analysis of differences in mushroom cultivation experiments

3 结论与讨论

双螺杆挤压技术是现代食品工程领域的新技术之一，物料的挤压处理过程是一个高温高压的过程，具有高温短时、膨化改性的特点，且原料营养成分损失少[22]。但目前市售的挤压机只能满足谷物、薯类、淀粉等匀质物料的加工，对于木屑、麸皮等纤维含量高、流动性差、颗粒大小差异较大的食用菌栽培基质原料并不适用。在前期自行研发适用于香菇培养料挤压灭菌加工的双螺杆挤压灭菌设备的基础上，开发香菇培养料双螺杆挤压灭菌新技术，具体通过Plackett-Burman 试验、最陡爬坡试验、Box-Behnken 响应面试验，确定香菇培养料双螺杆挤压灭菌的最佳工艺为原料初始含水量48.6%、喂料电机频率27 Hz、Ⅲ区温度162 ℃、木屑润水时间3 h、Ⅰ区温度90 ℃、Ⅱ区温度140 ℃、Ⅳ区温度130 ℃、螺杆电机频率21 Hz。该工艺加工的菌包坏袋率为2.75%，显著低于对照传统蒸汽灭菌的坏袋率4.00%，且能正常进行菌丝体培养、正常变色、正常出菇、菇型良好，表明双螺杆挤压灭菌可以应用在香菇培养料的灭菌加工上。

香菇等大多数食用菌都采用熟料袋栽模式，培养料灭菌是菌包加工的共性关键技术[23-25]。目前，国内外通用的灭菌方法为传统蒸汽灭菌方式，即将培养料装袋后放入灭菌柜内，通过蒸汽加热升温、达到设定温度后保温一定时间，移出冷却完成灭菌，都是依赖锅炉的间歇批次灭菌，存在着升温慢、时间长、能耗大、人工成本高等问题。而双螺杆挤压灭菌与传统蒸汽灭菌相比具有连续灭菌、物料灭菌受热时间短营养损失小、能耗低、省工省时、绿色环保等优势，作为传统灭菌的替代技术具有较大的优势。

双螺杆挤压灭菌中木质纤维素部分降解成小分子物质更有利于香菇的吸收利用，理论上具有增产和提高生物学效率的功能，但大规模种植应用时增产效果如何还有待明确。本研究仅针对香菇L808栽培适应性进行了初步研究，未来可通过香菇品种适用性研究、配套栽培技术改进研究进一步完善香菇培养料双螺杆挤压灭菌新技术体系。