基于网络药理学和实验验证探讨藤黄酸抑制膀胱癌的作用及机制

2024-03-14 03:48陈瑞琦熊洪刘宏伟广东医科大学附属医院泌尿外科研究室广东湛江524001
中南药学 2024年2期
关键词:藤黄划痕膀胱癌

陈瑞琦,熊洪,刘宏伟(广东医科大学附属医院泌尿外科研究室,广东 湛江 524001)

膀胱癌(bladder cancer,BC)是泌尿系统最常见的恶性肿瘤之一,是世界上第十大常见癌症[1]。数据显示,近年来我国膀胱癌的总发病率呈上升趋势[2]。膀胱癌根据其浸润深度可分为肌层浸润性膀胱癌(muscle-invasive bladder cancer,MIBC)和非肌层浸润性膀胱癌(non muscle-invasive bladder cancer,NMIBC)[3]。现阶段,新辅助化疗联合根治性膀胱切除术是目前治疗MIBC的标准方案,然而部分无法接受手术的患者只能采用化疗、放疗等方法,在治疗过程中会出现较大的不良反应[4]。经尿道膀胱肿瘤切除术联合术后膀胱灌注化疗或免疫治疗是NMIBC的常规治疗方案之一,但是治疗效果有限,具有很高的复发率[5]。因此,有必要寻找具有更好疗效且不良反应较小的治疗膀胱癌的潜在药物。

研究发现,中药在抗肿瘤方面具有多靶点、不良反应小、不易产生耐药性等特点[6]。藤黄是藤黄科植物藤黄(GarciniahanburyiHook.F.)分泌出的树脂,具有治疗痈疽、损伤出血、牙疳蛀齿等作用[7]。藤黄酸(gambogic acid,GA)是从藤黄中提取的主要化合物之一,具有抗氧化、抗炎等多种功能。研究发现,GA可抑制多种肿瘤细胞的增殖、迁移、侵袭能力,并促进其凋亡[8]。网络药理学是建立在药物-基因-疾病的多层次网络基础上的新兴学科,可以从整体上预测药物的作用靶点[9]。本研究通过网络药理学筛选GA抑制膀胱癌的潜在作用靶点,通过细胞实验验证,探讨GA抑制膀胱癌的作用及可能机制,为筛选出膀胱癌的潜在辅助治疗药物提供理论基础。

1 材料

1.1 数据库与软件

PubChem(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)数据库,PharmMapper(http://www.lilabecust.cn/pharmmapper/)数据库,UniProt(https://www.uniprot.org/)数据库,GeneCards(https://www.genecards.org)数据库,STRING(https://cn.string-db.org/),David(https://david.ncifcrf.gov)数据库,数据分析软件Cytoscape 3.9.1,在线网站Venny 2.1.0(https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/),在线网站微生信(http://www.bioinformatics.com.cn)。

1.2 材料

人膀胱癌UM-UC-3细胞(中科院上海细胞库),DMEM培养基(货号:C11995500BT)、胰蛋白酶(货号:25200072)(美国 Gibco 公司),藤黄酸(成都植标化纯生物技术有限公司,货号:PCS0866),Annexin V-FITC凋亡分析试剂盒、SDS-PAGE 凝胶配制试剂盒、BCA 蛋白浓度测定试剂盒(上海碧云天生物技术有限公司),胎牛血清(货号:Z7185FBS-500)、ECL-Western blot化学发光液(货号:310208)(美国 Zeta Life 公司),PI3 Kinase(PI3K)兔多克隆抗体、AKT 鼠单克隆抗体、Phospho-AKT(p-AKT)鼠单克隆抗体(美国Proteintech公司),Phospho-PI3 Kinase(p-PI3K)兔多克隆抗体(美国GeneTex公司),Cell counting Kit-8试剂盒(日本同仁化学研究所),Transwell小室(美国Corning公司),基质胶(广州市沃德生物科技有限公司)。

2 方法

2.1 获取GA的作用靶点

在PubChem数据库以“gambogic acid”为关键词获取GA 的3D结构式的sdf文件,将文件上传至 PharmMapper 数据库,得到GA作用靶点,再将靶点上传至 UniProt 数据库,通过ID mapping匹配靶点的基因名称。

2.2 获取膀胱癌的靶基因

以 “bladder cancer”为关键词,在GeneCards数据库检索膀胱癌的相关靶基因。

2.3 获取GA抑制膀胱癌的潜在靶基因

通过在线网站 Venny 2.1.0,取前两步获取的GA作用靶点和膀胱癌相关靶基因的交集,得到GA抑制膀胱癌的潜在靶基因。

2.4 蛋白互作网络构建

将GA抑制膀胱癌的潜在靶基因上传至 STRING数据库,设置物种为“Homo sapiens”,最低互动分数要求>0.400,隐藏网络中断开的节点,并将tsv数据文件导入Cytoscape 3.9.1分析,通过Betweeness Centrality算法得到潜在靶基因的中介中心性。

2.5 GO和KEGG分析

将得到的中介中心性最高的20个潜在靶基因上传至 DAVID 数据库,限制物种为“Homo sapiens”,选择GO 生物过程(BP)、细胞组分(CC)、分子功能(MF),KEGG 通路进行分析,将所得结果通过在线网站微生信进行可视化处理。

2.6 GA溶液的制备

将GA粉末配制成1000 μmol·L-1的GA水溶液,避光储存于-20℃冰箱,实验时稀释成实验所需浓度。

2.7 细胞培养和分组

将UM-UC-3细胞接种于培养皿,使用DMEM完全培养基(10%浓度胎牛血清),置于37℃、5%CO2细胞培养箱中培养,待细胞生长至80%以上时传代。实验时按照GA药物浓度(0、40、80、160 μmol·L-1)分为4组,0 μmol·L-1组为对照组。

2.8 CCK-8实验

取对数生长期UM-UC-3细胞,接种于96孔板,每孔3×103个细胞,置于细胞培养箱中培养,24 h后弃旧培养基,分别加入含有不同浓度GA的培养基,每组设置3个复孔,继续培养24、48、72 h,取出96孔板,每孔加入10 μL CCK-8 试剂,避光孵育2 h后检测各孔在 450 nm 波长处的光密度(OD)值,计算细胞增殖抑制率。增殖抑制率(%)=(对照组OD值-实验组OD值)/对照组OD值×100%。

2.9 细胞克隆形成实验

取对数生长期UM-UC-3细胞,以每孔1×103个细胞接种于6孔板,24 h后弃旧培养基,分别加入含有不同浓度GA的培养基,10 d后弃培养基,用PBS清洗,4%多聚甲醛固定,0.1%结晶紫染液染色,冲洗、晾干后拍照,计算克隆形成数目。

2.10 细胞划痕实验

取对数生长期UM-UC-3细胞,接种于6孔板,待细胞生长浓度超过90%后用200 μL规格的移液枪头划痕,弃旧培养基,分别加入含有不同浓度GA的培养基,显微镜下随机选取3个视野拍照,继续培养24 h后取出,在相同位置拍照,用Image J软件测量划痕面积,计算划痕愈合率。划痕愈合率(%)=(0 h划痕面积-24 h划痕面积)/0 h划痕面积×100%。

2.11 Transwell迁移实验

取对数生长期UM-UC-3细胞,接种于6孔板,待细胞完全贴壁后弃旧培养基,分别加入含有不同浓度GA的培养基,24 h后弃培养基,胰蛋白酶消化后用不含血清的DMEM培养基制成细胞悬液,调整细胞浓度,取200 μL细胞悬液(含4×104个细胞)加入上室,下室加入600 μL DMEM完全培养基,继续培养24 h后取出小室,4%多聚甲醛固定,0.1%结晶紫染液染色,冲洗、晾干后随机选取3个视野拍照,计算细胞迁移数。

2.12 Transwell侵袭实验

用无血清DMEM培养基按8∶1的比例稀释基质胶,取50 μL稀释后的基质胶铺于Transwell小室并放入培养箱,待基质胶凝固后取出,其余步骤同“2.1.1”项下Transwell 迁移实验。

2.13 流式细胞术检测细胞凋亡

取对数生长期UM-UC-3细胞接种于6孔板,待细胞完全贴壁后弃旧培养基,分别加入含有不同浓度GA的培养基,继续培养24 h后取出,收集培养基和贴壁细胞,重悬,取1×106个细胞,PBS清洗,离心后弃PBS,使用195 μL Annexin V-FITC结合缓冲液制成细胞悬液并移入流式管,分别加入5 μL Annexin V和10 μL PI,避光孵育20 min,使用流式细胞仪分析。

2.14 Western blot 实验

取对数生长期UM-UC-3细胞接种于培养皿,分别加入含有不同浓度GA的培养基,继续培养24 h后弃培养基,PBS清洗,提取总蛋白,BCA法测蛋白浓度,加热变性,置于-20℃冰箱保存。SDSPAGE凝胶配制试剂盒配置凝胶,每孔上样30 μg,经电泳、电转、封闭、切膜后加入对应一抗(GAPDH 1∶10 000,FoxO1 1∶2000,AKT 1∶2000,p-AKT 1∶2000,PI3K 1∶500,p-PI3K 1∶500),置于4℃冰箱孵育过夜。次日取出条带,洗膜3次后分别加入对应二抗,孵育1 h,洗膜3次,化学发光法曝光成像,Image J软件统计分析蛋白相对表达水平。

2.15 统计学分析

使用 SPSS 26.0和GraphPad Prism 8.0软件进行统计分析,所有实验重复3次,实验数据以均数±标准差表示,两组均数比较采用t检验,P<0.05表示差异具有统计学意义。

3 结果

3.1 GA抑制膀胱癌的潜在靶点

通过PubChem获得GA的3D结构式(见图1),通过PharmMapper数据库和UniProt数据库获得有效靶点219个;通过GeneCards数据库获取膀胱癌相关基因11 618个。将两者上传至Venny 2.1.0,取交集,得到GA抑制膀胱癌的潜在靶点57个。

图1 藤黄酸的3D结构式Fig 1 3D structural formula of gambogic acid

3.2 蛋白互作网络构建和核心靶点分析

通过使用STRING数据库,得到GA抑制膀胱癌潜在靶点的蛋白互作图(见图2),其中节点数量55个,边数60条,平均节点度2.18,平均局部聚类系数为0.416,蛋白互作富集P值为0.007 48。Betweeness Centrality算法得到中介中心性最高的20个靶点,见表1。

表1 藤黄酸抑制膀胱癌的潜在靶点(前20)Tab 1 Potential targets of inhibition of bladder cancer induced by gambogic acid (Top 20)

图2 藤黄酸抑制膀胱癌的潜在靶点的蛋白互作图Fig 2 Protein-protein interaction diagram of the potential targets of inhibition of bladder cancer induced by gambogic acid

3.3 GO和KEGG分析

将中介中心性最高的20个靶点进行GO和KEGG通路富集分析,得到GO分析条目66条,其中包括维持中性粒细胞内稳态等26个BP;囊泡膜等17个CC;参与氧气转运等28个MF,见图3;KEGG 通路富集分析显示GA抑制膀胱癌可能与PI3K/AKT、FoxO1、HIF-1等信号通路相关,见图4。通过查阅文献得知FoxO1作为FoxO家族的成员可以抑制膀胱癌,故后续选择FoxO1进行验证。

图3 藤黄酸抑制膀胱癌的20个潜在靶基因的GO富集分析Fig 3 GO enrichment analysis of 20 potential target genes which inhibit bladder cancer by gambogic acid

图4 藤黄酸抑制膀胱癌的20个潜在靶基因的KEGG通路富集分析Fig 4 KEGG pathway enrichment analysis of 20 potential target genes which inhibit bladder cancer by gambogic acid

3.4 GA抑制UM-UC-3细胞的增殖能力

CCK-8实验结果显示,GA处理24 h后,与对照组相比,各实验组UM-UC-3细胞的增殖均受到抑制,见表2;细胞克隆形成实验结果显示,与对照组相比,各实验组的克隆形成数目均降低,见图5。提示GA可抑制UM-UC-3细胞的增殖能力。

表2 藤黄酸对UM-UC-3细胞增殖能力的影响(±s,n=3)Tab 2 Effect of gambogic acid on the proliferation ability of UM-UC-3 cells (±s,n=3)

表2 藤黄酸对UM-UC-3细胞增殖能力的影响(±s,n=3)Tab 2 Effect of gambogic acid on the proliferation ability of UM-UC-3 cells (±s,n=3)

注:与对照组相比,*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001。Note:Compared with the control group,*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001.

组别药物作用时间OD值增殖抑制率/%对照组GA 40 μmol·L-1组GA 80 μmol·L-1组GA 160 μmol·L-1组24 h1.64±0.11-24 h1.43±0.08*13.79±1.23 24 h1.30±0.12**21.52±2.79 24 h1.08±0.05***36.92±3.40对照组GA 40 μmol·L-1组GA 80 μmol·L-1组GA 160 μmol·L-1组48 h3.46±0.02-48 h2.59±0.04***22.67±3.52 48 h2.11±0.10***37.01±2.41 48 h1.42±0.18***55.05±0.94 72 h4.22±0.08-72 h2.59±0.05***38.54±0.61 72 h1.98±0.05***53.09±2.12 72 h1.44±0.01***65.76±0.47对照组GA 40 μmol·L-1组GA 80 μmol·L-1组GA 160 μmol·L-1组

图5 藤黄酸对UM-UC-3细胞克隆形成能力的影响Fig 5 Effect of gambogic acid on the colony formation of UM-UC-3 cells

3.5 GA抑制UM-UC-3细胞的迁移和侵袭能力

细胞划痕实验结果显示,GA处理24 h后,与对照组相比,各实验组UM-UC-3细胞的划痕愈合面积降低,见图6;Transwell实验结果显示,GA处理24 h后,与对照组相比,各实验组UMUC-3细胞的迁移和侵袭数均降低,见图7。提示GA抑制UM-UC-3细胞的迁移和侵袭能力。

图6 藤黄酸对UM-UC-3细胞迁移能力的影响(×200)Fig 6 Effect of gambogic acid on the migration of UM-UC-3 cells(×200)

图7 藤黄酸对UM-UC-3细胞迁移和侵袭能力的影响(×200)Fig 7 Effect of gambogic acid on the migration and invasion ability of UM-UC-3 cells(×200)

3.6 GA促进UM-UC-3细胞的凋亡

细胞凋亡检测实验结果显示,GA处理24 h后,与对照组相比,各实验组UM-UC-3细胞的凋亡率均增加,见图8。提示GA可促进UM-UC-3细胞的凋亡。

图8 藤黄酸对UM-UC-3细胞凋亡的影响Fig 8 Effect of gambogic acid on the apoptosis of UM-UC-3 cells

3.7 GA调控UM-UC-3细胞PI3K/AKT/FoxO1信号通路的表达

Western blot 实验结果显示,GA处理24 h后,与对照组相比,各实验组UM-UC-3细胞的AKT蛋白表达水平未见变化,PI3K、p-PI3K均下调,FoxO1表达量上调;与对照组相比,GA 80、160 μmol·L-1组 UM-UC-3细胞的p-AKT表达量下调,见图9。提示GA可以下调PI3K、p-PI3K、p-AKT的表达,上调FoxO1的表达。

图9 藤黄酸对UM-UC-3细胞PI3K/AKT/FoxO1信号通路相关蛋白表达的影响Fig 9 Effect of gambogic acid on the expression of PI3K/AKT/FoxO1 signaling pathway-related proteins in UM-UC-3 cells

4 讨论

研究表明,中药可以直接抑制肿瘤的进展,也能减少化疗、放疗引起的不良反应,目前已经被广泛运用于肿瘤的辅助治疗上,具有一定的疗效[10]。GA是近年的研究热点之一,有多项研究发现GA具有抗肿瘤作用。例如GA以剂量依赖的方式抑制前列腺癌细胞的增殖能力,并诱导其凋亡[11]。此外,GA可以抑制结肠癌HCT116和CT26细胞的增殖、迁移和侵袭,并引发抗肿瘤免疫反应[12]。本研究发现,与对照组相比,GA处理后UM-UC-3细胞的增殖、迁移、侵袭能力均下降,提示GA可以抑制UM-UC-3细胞的增殖、迁移和侵袭能力;流式细胞术结果显示,GA处理后UM-UC-3细胞的凋亡率高于对照组,提示GA可以促进UM-UC-3细胞的凋亡。

本研究通过网络药理学分析,筛选出57个GA抑制膀胱癌的潜在靶点,其中EP300和NOS2是中介中心性最高的两个靶点。研究表明,EP300在膀胱癌中易发生突变,引起抗肿瘤免疫反应[13]。NOS2已被证明在多种癌症中高表达,并且可作为癌症预后的不良预测因子[14]。KEGG通路富集分析显示GA抑制膀胱癌与PI3K/AKT、HIF-1和FoxO1信号通路具有较高相关性。HIF-1是一个在生物体代谢过程中起关键作用的调节因子,在多种良性或恶性肿瘤的表达均上调[15]。FoxO是一个可调节多种生物过程的转录因子,在细胞的衰老、凋亡、分化、DNA损伤修复等方面都能发挥功能,并且具有抑癌作用[16]。PI3K/AKT信号通路是细胞内最重要的信号通路之一,参与多种细胞功能;但PI3K/AKT信号通路在癌症的发展过程中往往会过度激活,促进癌症的发展[17]。研究发现,FoxO转录因子在多种癌症的发展过程中会作为PI3K/AKT信号通路的下游靶点而受到抑制[18]。例如PI3K/AKT信号通路通过抑制FoxO1的磷酸化,调控hnRNP-F蛋白的表达,进而促进膀胱癌的增殖[19]。因此,本研究选择PI3K/AKT/FoxO1通路,通过Western blot进行验证,结果显示GA可以下调PI3K、p-PI3K、p-AKT的表达,并上调FoxO1的表达,所以推测GA抑制膀胱癌的作用可能和PI3K/AKT/FoxO1信号通路有关。

综上所述,本研究基于网络药理学及细胞实验方法,探讨了GA抑制膀胱癌的作用及可能机制。研究表明,GA可以抑制膀胱癌UM-UC-3细胞的增殖、迁移、侵袭能力,并促进其凋亡;其机制可能与调控PI3K/AKT/FoxO1信号通路有关。但本研究存在一定的不足之处,研究机制不够深入,后续需通过挽救实验及动物实验进一步验证。

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