马麝出血症组织灭活疫苗的制备及免疫保护性分析

马海云,张玉清,郭潞莎,包世俊

(甘肃农业大学动物医学学院,甘肃兰州 730070)

马麝(Moschuschrysogaster,alpine musk deer)亦称香樟、高山麝,是我国特有的麝科、麝属、麝种动物,也是我国一级重点保护野生动物,被列入世界自然保护联盟(International Union for Conservation of Nature,IUCN) “濒危”野生动物[1-2]。麝香是雄麝香腺囊的分泌物,是香水工业中最古老的原料之一,亦是我国名贵的中药材,对神经系统和心血管系统有兴奋作用,被用作许多中药名方如麝香保心丸、六神丸、云南白药等[3]。迄今为止,很难找到合适的天然或合成物质来替代传统医学中的麝香,因此麝香有极高的经济与药用价值。马麝在我国青海、宁夏、甘肃、四川、云南等地均有分布,其主要栖息在裸岩山地的灌木丛和草丛等地,是典型的灌木丛、森林边缘动物[2],由于过度猎捕和栖息地的破坏,我国马麝种群数量急剧减少。为了保护我国独特的麝资源,20世纪90年代初,甘肃兴隆山国家级自然保护区建立了第1家马麝养殖场,目前保护区马麝是我国数量最大的种群。但多种传染性疾病的流行严重影响马麝养殖和繁育。

马麝病毒性出血症是急性和高度致死性传染病,以马麝心、肝、脾、肺、肾、小肠、脑等组织和器官充血、出血和坏死为特征。通常1岁内最常发病,6月龄左右病死率较高,大多数病例死于无症状,一些病程稍长的表现为抑郁,停止进食和饮水,并伴有角弓反张等神经系统症状[4-6]。采集病料研究确定马麝出血症的病原为一种杯状病毒[7],与兔出血症病毒(Rabbit hemorrhagic diease virus,RHDV)的核酸序列高度相似,尤其与RHDV中国分离株HB株的相似性高达98.7%,且能够感染并致死家兔,因此,该病毒曾被命名为马麝出血症病毒[8]。为提高对马麝出血症的防控能力,需研制可用于马麝出血症有效预防的疫苗,本文用家兔扩增马麝出血症病毒的基础上,收集致死兔肝脏,制备病毒的肝脏组织匀浆上清,并经甲醛灭活后用白油佐剂配制马麝出血症的组织灭活疫苗,进而评价疫苗的免疫效果和保护效果,为马麝出血症的疫苗防控提供有效手段。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 毒株与实验动物 马麝出血症病毒(McHDV)毒株由甘肃农业大学传染病学实验室从我国兴隆山马麝繁育基地病死马麝体内分离保存;人“O”型红细胞来源于血站;健康非免疫新西兰白兔购于甘肃省兰州市某个体养殖户。

1.1.2 主要试剂 兔瘟-巴氏杆菌二联苗;白油佐剂;甲醛溶液(40%)Biosharp; NaCl、KCl、KH2PO4、Na2HPO4、葡萄糖、柠檬酸钠、柠檬酸等化学试剂,上海生工生物工程技术服务公司产品;PBS缓冲液:NaCl 8.0 g、KCl 0.2 g、KH2PO41.84 g、Na2HPO40.2 g,蒸馏水定容至100 mL,用pH检测仪测定pH为7.4,取10 mL 10×PBS缓冲液于90 mL蒸馏水中,配制成1×PBS缓冲液,调用pH至7.2。1% 红细胞悬液:吸取1 mL抗凝血于2 mL离心管,1 500 r/min离心10 min,弃去血浆,红细胞沉淀中加入1×PBS缓冲液(红细胞体积的2倍),轻晃,洗涤红细胞(上下轻晃,直至红细胞均匀),1 500 r/min离心10 min,弃上清,反复洗涤多次,直至上清清亮无色,按照红细胞体积1∶100的比例加入1×PBS,配制1%红细胞悬液,并置于4℃冰箱保存备用。

1.1.3 主要仪器 高压锅(LDZX-50KBS),上海申安医疗器械厂生产;超净工作台(ZHJH-1112),上海智城分析仪器制造有限公司生产;电子天平,梅特勒-托利多仪器上海有限公司产品;离心机,上海南荣实验室设备有限公司产品;微型振荡器(MM-1),台州市艾测仪器有限公司产品;恒温培养箱,上海跃进医疗器械有限公司产品。

1.2 方法

1.2.1 抗原的制备 ①病料的处理。取实验室冻存的病料,加10倍体积1×PBS缓冲液制备组织匀浆,反复冻融3次,10 000 r/min离心10 min,取上清除菌后皮下注射2只健康非免疫新西兰大白兔,1 mL/只,观察并记录试验兔的临床症状和病理变化。无菌采取死亡兔的肝脏组织,除去脂肪和结缔组织,称量后充分研磨,与1×PBS缓冲液按1∶10的比例混合后匀浆,反复冻融3次后10 000 r/min离心15 min,取上清,用0.22 μm除菌过滤过滤除菌后分装备用。②毒种检验(血凝试验)。应用血凝试验测定病毒悬液的效价,试验设3个平行组,并于96孔V型板上进行:1～12孔先加入25 μL 1×PBS缓冲液;取25 μL病毒悬液加入第1孔后倍比稀释到11孔,从11孔吸弃25 μL,12孔为空白对照;每孔加入1%红细胞悬液25 μL,置4℃ 45 min后判定结果。③灭活疫苗的制备。将毒种检验测定的血凝效价为8 Log2的病毒悬液作为候选毒株,向处理分装过后的病料悬液中加入40%甲醛(使其终浓度为0.4%),置37℃振摇灭活48 h,可4℃保存(未加佐剂组织灭活苗),灭活振摇后的组织悬液与白油佐剂按照1∶1的比例混合均匀后,置于乳化机乳化30 s,重复3～4次使之充分乳化。

1.2.2 疫苗检验 ①无菌检验。取制得的疫苗,分别在血液琼脂培养基和普通培养基上划线,37℃培养48 h,若无杂菌生成,则该疫苗合格,按照《中华人民共和国兽用生物制品规程》附录进行。②灭活苗物理性状检验。将灭活疫苗3 000 r/min离心10 min,观察其分层情况。取少量灭活疫苗滴于蒸馏水表面,观察疫苗的扩散情况。③安全性检验。取健康非免疫新西兰大白兔4只,每只皮下接种制得的疫苗4 mL,连续观察14 d,分析疫苗的安全性。④免疫效力检测——血清抗体水平检测。取12只健康非免疫兔,随机分为4组,每组3只,试验组分别皮下注射1 mL未加佐剂组织灭活苗、白油佐剂组织灭活苗,对照组皮下注射1 mL PBS缓冲液,商品苗对照组皮下注射1 mL商品苗。免疫后0、7、14 d于兔子耳缘静脉采血,采集的血液放于37℃温箱30 min后,3 000 r/min离心10 min,上清液即为分离的血清。对所分离的血清进行处理,将所有血清置于56℃水浴锅中30 min灭活。血凝抑制试验,在96孔V型板上1～11孔加入25 μL PBS缓冲液,第12孔加入50 μL PBS缓冲液,将待检血清加入第1孔开始倍比稀释到11孔弃去,1～11孔加入4单位病毒(4单位病毒的配制:以血凝试验的结果为依据,抗原的血凝效价为8 Log2,因此1个HAU为8 Log2,4个HAU为6 Log2,即4单位抗原的稀释倍数为1∶64),置于微型振荡器上摇匀,振荡3 min,37℃温箱放置30 min,向每孔加入25 μL 1%红细胞悬液,振荡混匀,4℃放置45 min,待PBS对照孔的红细胞完全沉积后观察并判定结果。试验同时设阳性血清、阴性血清和空白对照。⑤攻毒保护试验。对免疫14 d后的各组兔子皮下注射强毒(含1 000 LD50)1 mL,观察其7 d的状况,记录各组兔子的发病和死亡情况,计算保护率。

2 结果

2.1 灭活疫苗物理性状及安全性试验结果

制备的灭活疫苗经离心,未出现分层现象,证明乳化充分。经血琼脂培养基和普通培养基培养后,无杂菌生长。制备的灭活疫苗物理性状成乳白色,将疫苗滴于蒸馏水上呈圆形油滴状,无分散现象。健康非免疫新西兰大白兔颈部皮下注射制备的疫苗,观察14 d,无不良反应和异常表现,表明制备的灭活疫苗具有良好的安全性。

2.2 血凝抑制试验与攻毒保护结果

第7天未加佐剂组织灭活疫苗组的效价分别为6 Log2、7 Log2、7 Log2,白油佐剂灭活疫苗组的效价分别为11 Log2、7 Log2、8 Log2,商品苗组的效价分别为8 Log2、7 Log2、7 Log2,对照组均无效价。第14 天未加佐剂组织灭活疫苗组的效价分别为8 Log2、7 Log2、7 Log2,白油佐剂灭活疫苗组的效价分别为11 Log2、9 Log2、9 Log2,商品苗组的效价分别为8 Log2、7 Log2、8 Log2,对照组均无效价(表1)。第7天未加佐剂的组织灭活疫苗组全部存活,白油佐剂灭活疫苗组死亡1只,商品苗组全部存活,对照组全部死亡(表2)。

表1 免疫兔血清第7天、第14天抗体效价变化

表2 不同免疫剂量对马麝病毒的免疫保护结果

对照组在预计时间内全部死亡,死前精神沉郁,饮食欲废绝,死后出现角弓反张现象。剖检病死兔可见全身出现败血性变化(图1),病理剖检可见“红气管”,气管存在点状出血、心脏淤血、肺脏出现淤血和大小不等的出血斑点、肝脏质脆和淤血、肾脏肿大和淤血很明显等病理特征,根据临床症状及剖检病变特征确定死因是马麝出血性病毒感染所致。

A～B.对照组兔心脏,心脏内有明显淤血; C～D.对照组兔肺脏,明显充血、淤血;E.对照组兔气管,可见点状出血,切开气管时有淤血;F.对照组兔肾脏,存在明显淤血,相较于正常肾脏较黑;G.对照组兔肝脏,质脆,明显淤血

3 讨论

关于麝属动物的研究主要是通过样线法、样方法、粪堆计数法及重复法,对麝类种群空间分布、种群数量与密度、栖息地的保护、生存环境的选择及适应性分析等进行调查、研究和分析,根据利害因素优化马麝的生存环境,减少干扰因素[9-13]。马麝疾病的治疗研究较少,李斐然等[14]对林麝胃肠道(胃肠溃疡、瘤胃迟缓、便秘)和泌尿道(尿道炎、膀胱结石)相关疾病的诊治进行了探索和完善,为马麝疾病诊治和相关疫苗的研发提供一定的参考。马麝病毒性出血症发病急、致死率高,对马麝种群的繁育和生存造成严重威胁[4]。本文主要研究马麝病毒性出血症灭活疫苗的制备,分为未加佐剂灭活组织疫苗和白油佐剂灭活组织疫苗,阳性对照组为商品疫苗组,阴性对照组皮下注射1 mL PBS缓冲液。结果证明疫苗无菌检验、物理性状检验以及安全性检验符合要求。试验过程中分别对试验兔测定7 d、14 d的HI,结果显示,相较于商品疫苗组,白油佐剂组在7 d、14 d均具有较高的效价,表明该疫苗可以在短时间产生较高效价,并且维持时间较长。未加佐剂组产生效价时间较慢,效价较低,但仍存在免疫效果。攻毒后对照组在预计时间内死亡,而试验组兔存活,白油佐剂组死亡1只。在动物攻毒试验中,未加佐剂组保护率为100%,白油佐剂组保护率为66.7%,商品疫苗组保护率为100%。可能与试验动物的个体差异、身体状况、免疫耐受及周围环境对试验动物的影响等因素有关,本试验中不同剂量免疫家兔时,每组仅用了3只兔子,未达到小动物试验基本样本数,没有进行重复试验,白油佐剂组死亡1只,造成白油佐剂组保护率降到66.7%。本试验的攻毒保护结果说明疫苗切实可行,能够起到免疫保护的作用。本试验证明所制备疫苗有潜力应用于疫苗生产,降低生产成本。同时也有利于预防马麝病毒性出血症的发生和提高马麝的存活率,从而对马麝起到一定的保护作用,并为这一濒危物种的繁殖提供有力保障。