葛根素对妊娠期糖尿病大鼠母体和胎儿的影响

钱 坤,宋祎一,曹 莉

[1. 苏州大学医学院,江苏 苏州 215123;2. 天大药业(珠海)有限公司,广东 珠海 519070]

妊娠糖尿病(gestational diabetic mellitus,GDM)是指在怀孕期间首次发病或首次被发现的碳水化合物不耐受导致的高血糖,是目前妊娠期最常见的并发症之一。随着人们饮食生活习惯的改变及婚育年龄的推迟,我国GDM的发病率明显上升。一份2019年发表的文献报告利用Mate分析对2013-2017年报道我国GDM发生率的25 篇论文进行了进一步汇总分析,统计受试者79 064 名,结果显示GDM在中国的发病率高达12.8%～16.7%[1]。2022年一份对我国41 067 名妊娠妇女的临床研究报道GDM发病率为16.3%[2]。GDM不仅可引发糖尿病并发症、妊娠高血压、羊水过多、胎膜早破、感染、早产、难产等,对母亲健康造成严重威胁;还易引发胎儿畸形、缺氧、巨大儿及新生儿呼吸窘迫综合征、低血糖和其他并发症,增加胎儿和新生儿的死亡率[3-4]。因此,GDM的治疗及相关不良妊娠的控制受到广泛重视。

许多中药都有调控血糖的药效,特别是药食两用的葛根广受关注。葛根的传统功效为解肌退热、生津止渴、升阳止泻、透发疹斑等。葛根素(puerarin, Pue )是葛根中提取的一种异黄酮类成分,化学名为4,7-二羟基-8-β-D-吡喃葡萄糖醛基异黄酮,现代药理学研究表明其具有改善微循环、抑制醛糖还原酶活性、改善胰岛素抵抗和降血糖等作用,在临床上Pue不仅用于治疗冠心病、心绞痛、心肌梗塞,其应用于糖尿病及并发症的辅助治疗也已有30余年的历史[5-6]。诸多研究者对Pue与其他药物联合应用治疗GDM进行了临床和实验探索[7]。然而目前单独评价Pue,特别是口服Pue可否有效控制GDM母体血糖水平,改善妊娠结局,尚罕见报道。本文建立GDM大鼠模型,观察口服Pue对GDM母体的疗效及对胎儿生长发育的影响,为临床用药提供客观的实验依据。

1 材料与方法

1.1 动物SPF级SD大鼠,雌性70 只,雄性20 只,体质量(250±20) g;由苏州大学实验动物中心提供,生产许可证号：SCXK(苏)2007-2008,使用许可证号：SYXK(苏)2007-0037。SPF动物房环境温度(22±2) ℃,相对湿度40%～70%,昼夜交替12 h。

1.2 试剂链脲佐菌素(streptozotocin,STZ),BioFroxx 公司(批号：EZ2921B400);Pue,西安艾沃生物科技有限公司(纯度：80%,批号：AW-110821);盐酸二甲双胍片(metformin, Met)昆山培力药品有限公司(批号：1112136);50%葡萄糖注射液,中国大冢制药有限公司(批号：1H89H20);柠檬酸,南京新百药业有限公司(批号：0806117);柠檬酸钠,中诺药业有限公司(批号：08089416);戊巴比妥钠,Sigma 公司(批号：P3761);生理盐水,山禾齐都药业有限公司(批号：15B21121003);4%多聚甲醛通用型组织固定液,兰杰柯科技有限公司(批号：22343640)、血糖试纸,三诺生物传感股份有限公司(批号：3824NE)。

1.3 仪器电子天平(上海精天电子仪器有限公司;FA604A)、电子分析天平(Mettler Toledo;ME104)、pH计(Mettler Toledo;Five Easy Plus)、血糖仪(三诺生物传感股份有限公司,GA-3)。

1.4 方法

1.4.1GDM大鼠模型建立及给药方案[8]将大鼠按雄雌比例2 ∶1合笼,次晨检查雌鼠阴道口及笼具底盘,发现有阴栓者定为妊娠第1天,标记孕鼠,记录孕期,并将雌、雄鼠分开。除正常对照组外,其余孕鼠用于制备GDM模型：孕鼠妊娠第5晚禁食12 h后,按30 mg·kg-1剂量尾静脉注射2%的STZ溶液(需用柠檬酸缓冲液新鲜配制：柠檬酸2.1 g加入双蒸水100 mL中配成A液,柠檬酸钠2.94 g加入双蒸水100 mL中配成B液。STZ药液配制：将A、B液按1 ∶1混合后,调整pH至4.4,加入STZ配置成2%的STZ溶液)。注射后立即给予大鼠正常供食供水。注射72 h后,用血糖仪检测孕鼠空腹血糖(提前禁食8 h)。空腹血糖11.3 mmol·L-1以上,且尚未流产者为造模成功。

将造模成功的孕鼠,根据其空腹血糖,均匀分为模型对照组(Model组)、阳性对照二甲双胍组(Met组)、葛根素组(Pue组),每组20只。将未造模的10只孕鼠设为正常对照组(Control组)。各组均按5 ml·kg-1体质量连续灌胃给药12 d,Met给药剂量为160 mg·kg-1,Pue给药剂量为250 mg·kg-1,Model组及Control组均给予等体积蒸馏水。

1.4.2孕鼠空腹血糖监测及糖耐量实验 分别于给药第5天、第10天检测尚未流产的孕鼠糖耐量。孕鼠禁食8 h后,按2 g·kg-1的剂量灌胃给予50%葡萄糖溶液,分别于0 min、30 min、60 min、120 min尾静脉取血,用血糖仪即时检测各时间点的血糖值(BG),并计算血糖曲线下面积(AUC=(BG 0+BG 30)×0.5/2+(BG 30+BG 60)×0.5/2+(BG 60+BG 120)×0.5/2)。另外,分别于首次给药前,以及末次给药1 h后,以同样方法检测孕鼠空腹血糖值(见 Fig 1)。

Fig 1 The schematic experimental schedule

1.4.3监测孕鼠常规状态 每日记录孕鼠体质量,观察基本体征,记录流产情况,计算各组流产率=流产孕鼠只数/孕鼠总只数×100%。

1.4.4胎鼠血糖及生长情况检查 孕鼠妊娠第19晚禁食10 h,次日末次给药1 h后,麻醉行剖腹产,依次剪开孕鼠腹部皮肤、肌肉层、子宫壁、羊膜囊,剥离胎盘,取出胎鼠,观察畸形情况并计算各组胎鼠宫内生长受限发生率=孕育宫内生长受限胎鼠的孕鼠只数/未流产的孕鼠只数×100%。称量胎盘重量、胎鼠的身长(头顶至尾尖)、尾长(尾根至尾尖)、体质量;分离胎鼠心脏、肝脏、肾脏及脑组织。摘取胎心时,将滴出的血液滴入血糖试纸,用血糖仪检测胎鼠血糖。各脏器用滤纸吸取血液后,称量重量,并计算脏器指数=脏器重/体质量×100%。

2 结果

2.1 Pue对GDM孕鼠空腹血糖及糖耐量的影响

结果仅统计未流产的孕鼠数据(Control 组10只, Model组8只,Met组13只,Pue组16只)。给药治疗前,GDM孕鼠空腹血糖明显高于Control组,有显著性差异(P<0.01),Model组、Met组、Pue组GDM孕鼠空腹血糖水平相当。给药后,Met组孕鼠空腹血糖逐渐降低,末次给药后空腹血糖低于给药前,有显著性差异(P<0.01),但仍未降到正常水平;Met组孕鼠末次给药后空腹血糖与Control组相比有显著性差异(P<0.01);Pue组孕鼠空腹血糖高的状况与其给药前比较,未见明显改善(P>0.05),但与Model组孕鼠持续升高的空腹血糖相比,已得到明显控制,两组间比较有显著性差异(P<0.01)(见Fig 2A)。给药第5天,两个给药组孕鼠糖耐量均得到一定程度的改善,AUC均明显低于Model组,有显著性差异(P<0.01)(见Fig 2B、2C);给药第10天,Met组孕鼠糖耐量进一步改善,Pue组则与其第5天相比变化不大(见Fig 2D、2E)。

Fig 2 Effect of oral Pue on fasting blood glucose and glucose tolerance in pregnant rats

2.2 Pue对GDM孕鼠基本体征的影响孕鼠静脉注射STZ后,体质量下降,由于尿量增多,垫料易潮湿并有烂苹果气味,毛色失去光泽。随着孕期延长,各组孕鼠的平均体质量均有所增加。但在妊娠末期(妊娠第19天),GDM各组孕鼠体质量均明显低于Control组,具有显著性差异(P<0.01),且体质量个体差异大,其主要原因是GDM引起的流产导致孕鼠体质量突然下降,这种情况在Model组尤为明显(见Fig 3A)。将各组未流产的孕鼠和中途流产的孕鼠体质量分开统计,则Model组未流产孕鼠体质量较Control组略有增高,而流产鼠体质量则低于其自身孕初期体质量;两个给药治疗组未流产孕鼠体质量明显小于Control组和Model组,差异均具有统计学意义(P<0.05,P<0.01),而这两个给药组流产鼠的体质量则较Model组流产孕鼠明显增加,且均有显著性差异(P<0.05,P<0.01),两组之间差异无统计学意义(P>0.05)(见Fig 3B)。

Fig 3 Effect of oral Pue on body weight of pregnant rats

2.3 Pue对GDM孕鼠流产率的影响各组GDM孕鼠均有流产现象,流产后有的尚可见子宫内留存有胎盘,有的子宫内已无残留,仅见子宫供血血管依旧扩张充盈(见Fig 4A、4B)。Control组无孕鼠流产;Pue组孕鼠流产率为20%,仅为Model组孕鼠流产率(达60%)的1/3,比Met组(孕鼠流产率为35%)降低了15%(见Fig 4C)。

Fig 4 Effect of oral Pue on rate of abortion in pregnant rats

2.4 Pue对GDM胎鼠血糖及宫内生长受限的影响在妊娠第20天,对孕鼠行剖腹产。在部分孕鼠子宫内发现有宫内生长受限胎鼠(体质量<1 g,且身体颜色明显偏黄),Model组宫内生长受限发生率达62.5%,Pue组为56.3%,Met组为30.8%(见Fig 5A、5B),Control组未见宫内生长受限胎鼠。胎鼠血糖仅统计无生长受限的胎鼠。Model组胎鼠血糖明显高于Control组,有显著性差异(P<0.01);Pue组胎鼠血糖值较Model组降低明显,有显著性差异(P<0.01),但仍明显高于Control组,差异也具有统计学意义(P<0.05);而Met组胎鼠血糖不仅明显低于Model组,甚至低于Control组,且均有显著性差异(P<0.01),见Fig 5C。

Fig 5 Effect of oral Pue on blood glucose and growth restriction in fetal rats

2.5 Pue对GDM胎鼠生长发育的影响胎鼠数据仅统计无生长受限的胎鼠。GDM各组胎盘重量较Control组明显增加,具有显著性差异(P<0.05),各给药组与Model组比较,差异无统计学意义(P>0.05)(见Fig 6A);Model组胎鼠体质量、身长都大于Control组,差异具有统计学意义(P<0.01),Met组和Pue组胎鼠体质量和身长均接近Control组,明显低于Model组,有显著性差异(P<0.01);Pue组胎鼠体质量偏轻,身长较短,但与Control组和Met组比较,差异均无统计学意义(P>0.05)(见Fig 6A、6B)。

Fig 6 Effect of oral Pue on body weight, placenta weight, body length and tail length in fetal rats

与Control组胎鼠相比,Model组胎鼠的脑重指数明显降低,组间比较差异显著(P<0.01);心重指数和肝重指数也呈现一定的降低趋势,肾重指数则表现出一定升高,但都与Control组相比,差异无统计学意义(P>0.05)。与Model组胎鼠相比,Met组和Pue组胎鼠脑重指数均明显增加,具有统计学差异(P<0.05,P<0.01),其中Pue组更接近Control组水平。Pue组胎鼠心重指数和肝重指数较Model组增高明显,具有显著性差异(P<0.05,P<0.01)(见 Tab 1)。

Tab 1 Effect of oral Pue on organ indices of heart, liver, kidney and brain in fetal

3 讨论

妊娠期母体在多种激素的相互作用和能量代谢明显改变的状况下,更容易发生胰岛素抵抗和糖代谢异常,进而引发糖尿病,约50%的GDM孕妇会成为终身糖尿病患者[9]。此外,GDM孕妇感染、妊高征、酮症酸中毒的患病率明显高于正常孕妇,同时羊水量异常、胎盘早剥、流产、早产;胎儿畸形、宫内发育迟缓、巨大儿,以及新生儿死亡等不良妊娠结局的发生率均明显增加[10-11]。有些婴儿即使在出生时未表现出明显异常,然而其一些重要脏器的功能却潜在诸多患病风险[12]。因此,对GDM的治疗不仅要控制孕妇的血糖水平,改善其胰岛素敏感性;更应降低孕妇及胎儿GDM相关并发症的发生。我国2022版《妊娠期高血糖诊治指南》[13]和美国2023版指南(《糖尿病分类与诊断》《妊娠期糖尿病管理》)在GDM药物治疗上均建议把胰岛素作为治疗GDM的首选药物[14-15]。然而,GDM患者对注射的给药方式接受度不高,而口服用药则具有更高的依从性。

有临床研究者利用Mate分析比较三种降糖药(胰岛素、甘布瑞德和Met)用于GDM的有效性和安全性,结果显示：与甘布瑞德和胰岛素相比,Met不仅能显著降低母亲餐后血糖水平及新生儿进入新生儿重症监护室的比例,而且新生儿体质量明显下降[16]。但本实验结果显示：虽然Met确实可以降低GDM流产率和胎儿宫内生长受限发生率,但却可引起胎鼠血糖显著低于正常胎鼠。葡萄糖是妊娠期胎儿能量的主要来源,因此这一点不该被忽视。这与中美指南中指出的Met和格列本脲都可通过胎盘屏障影响胎儿,存在潜在的风险是一致的[13-15]。同样其他口服化学降糖药物也都缺乏长期安全性数据。因此,很多研究者和临床医生期望在中药中寻找治疗GDM安全有效的口服药物。

Pue就是目标之一[17],然而Pue用于治疗GDM的疗效和安全性同样有待深入研究。本文通过尾静脉注射STZ的方法建立GDM大鼠模型,从孕鼠和胎鼠两个角度,比较全面地评估了口服Pue治疗GDM及干预其妊娠结局的作用。实验结果显示：口服Pue确实可以显著缓解GDM持续升高的空腹血糖,改善其糖耐量,虽然在降低孕鼠和胎鼠血糖方面效果不如Met;但在降低流产率和缓解GDM导致的母体体质量过度增加方面则优于Met。这提示Pue降低GDM流产率和控制母体体质量方面的作用机制不仅仅是控制血糖和改善糖代谢,很可能与其改善微循环和抑制炎症应激等机制有关[17-18]。Pue组胎鼠的血糖显著低于Model组,但仍高于正常胎鼠。该结果提示：由于Pue干预母体血糖效果并不算理想,以及其在改善子宫内膜微循环方面的潜在机制,使胎鼠血糖未得到很好的控制。另外,Pue组孕鼠的流产率虽然最低,但胎儿宫内生长受限发生率却接近Model组,这说明Pue在改善胎盘功能方面疗效也算不理想。但在无生长受限的胎鼠生长发育的相关指标上,口服Pue却表现出减少巨大儿的发生,促进胎儿重要脏器的发育的作用。Model组胎鼠,体质量和身长均显著高于Control组,这与临床上GDM巨大儿发生率高是一致的;Met组和Pue组胎鼠体质量和身长均接近Control组;GDM各组胎盘重量都显著高于Control组,但Pue组最接近于Control组。进一步称取胎鼠的心、肝、肾、脑等重要脏器,计算并比较脏器指数可初步判断这些器官的发育情况。Model组胎鼠脑的脏器指数显著低于Control组,摘取脏器时,也明显发觉Model组胎鼠较其他组胎鼠的脑组织更软嫩易碎;而Met组和Pue组胎脑的脏器指数均显著高于Model组,且Pue组胎脑无论是脏器指数还是质地都更接近于正常胎鼠。Model组胎鼠心、肝、肾的脏器指数与Control组比较虽无统计学意义,但也表现出一定的变化趋势,即：心、肝的脏器指数降低,而肾的脏器指数升高;这些趋势在Met组和Pue组均得到了明显的缓解。对胎鼠脑、心、肝、肾进行石蜡切片和HE染色,未能发现组织形态学上明显的差异,这可能与石蜡切片制备过程中多次脱水有关。这些结果提示：Pue可明显改善GDM引起的胎儿重要脏器发育异常,降低其日后潜在患病风险。

综上所述,单独口服降糖药用于治疗GDM,无论是西药的Met还是中药中提取的Pue,均未能达到十分令人满意的疗效,尽管其中的机制尚不清楚,且大鼠与人之间存在种属差异,但本实验结果仍可给临床用药提供一定的有价值的参考。中美两国指南中均指出70%～85%的GDM患者可以仅通过改变生活方式控制血糖水平,对GDM孕妇进行健康管理可改善妊娠结局(证据等级A级)[13-15]。近一步结合本文实验结果,提示：根据GDM患者病情和胎儿发育情况,确定不同方案的综合疗法更为可行。