基于网络药理学和分子对接方法探讨健脾利湿养肝方治疗慢加急性肝衰竭的作用机制

黄 琦,李 静,马文峰,韩志毅,孙嘉玲,张 卫,孙新锋,陈剑平,周小舟,

[1. 广州中医药大学第四临床医学院,广东 广州 510006;2. 深圳市中医院国家临床肝病(中医)重点专科,广东 深圳 518033;3. 澳门科技大学中医药学院,澳门 999078;4. 深圳市中医院中药制剂研究重点实验室,广东 深圳 518033]

慢加急性肝衰竭(acute-on-chronic liver failure,ACLF)是继发于慢性肝病的一个危急重症综合征候群,临床症状复杂多变,并且尚无特效的治疗方法。在慢性肝病中的发病率常大于10%,且死亡率可达50%以上[1]。西医对ACLF的治疗主要是处理诱发事件、减少炎症反应及防止器官衰竭等对症支持治疗。中医没有ACLF病名,根据其复杂多样的症状,可将其纳入“急黄”、“瘟黄”、“鼓胀”、“血证”、“肝厥”等重症范畴。现代中医总结本病辨证定位多以肝、脾为主,辨证定性则多以湿热、气虚为主,病理变化过程多呈现为“湿热-热毒-瘀虚”[2]。病久传脾,而热邪亦可伤阴血,且“见肝之病,知肝传脾”,故中医治疗以调和气血为大法,气血运行畅达,则病情向好。

前期本课题通过对全国不同区域18家单位962例ACLF及慢性肝衰竭进行多中心大样本临床观察发现：临床联合中药复方治疗可有效降低血清内毒素水平、减少并发症并降低病死率[3]。在此基础上,筛选出有效中药方剂健脾利湿养肝方(后简称养肝方),其由黄芪、绵茵陈、山药、山茱萸、草果、田基黄、焦山楂、砂仁、香附组成,具有健脾益气、清利湿热的功效[4]。

近年来中医在理论、临床、中药三方面的分子生物研究已经起步,网络药理学和分子对接技术可以从中医理论上拓展生物信息学的空间,在中药临床疗效基础上说明分子机制,并深化对中药的基因研究[5]。本研究基于网络药理学和分子对接方法,构建养肝方治疗ACLF的中药-成分-靶点-疾病网络关系,并对其潜在靶点和分子机制进行了系统地研究。

1 材料与方法

1.1 网络药理学方法

1.1.1养肝方活性成分和靶点搜集 在中药系统药理学数据库与分析平台(TCMSP,https：//tcmsp-e.com/)、BATMAN-TCM生物信息学分析平台(http：//bionet.ncpsb.org/batman-tcm/)及SwissTargetPrediction(http：//swisstargetprediction.ch/)数据库查找获得养肝方中黄芪、绵茵陈、山药、山茱萸、草果、田基黄、焦山楂、砂仁、香附的所有有效成分及作用靶点,选取人源靶点,合并删除重复靶点。

1.1.2ACLF疾病靶点搜集 使用Acute-on-chronic liver failure及Acute on chronic liver failure作为关键词,搜索DrugBank(https：//www.drugbank.ca/),人类疾病相关的基因与突变位点信息的数据库(Disgenet,http：//www.disgenet.org/home/),基因数据库(GeneCards,https：//www.genecards.org/),治疗靶标数据库(TTD,http：//db.idrblab.net/ttd),人类孟德尔遗传病数据库(OMIM,https：//www.omim.org/),获得ACLF疾病相关靶点,合并所有靶点并去除重复靶点。

1.1.3养肝方与ACLF相关靶点交集的构建 养肝方的作用靶点与ACLF疾病靶点使用韦恩图取交集,获得养肝方治疗ACLF作用靶点。

1.1.4构建PPI蛋白互作网络关系图及筛选关键作用靶点 将养肝方治疗ACLF作用靶点上传到STRING数据库 (http：//string-db.org)获取 PPI信息。置信度得分为 0.7。以 TSV格式导出后由Cytoscape可视化,构建中药-靶点-疾病的网络关系图。使用Cytoscape中Network analyzer和CytoNCA计算网络拓扑参数及阈值,包括度中心性(degree)、紧密中心性(closeness centrality)、介数中心性(betweenness centrality)。

1.1.5养肝方治疗ACLF作用靶点的富集分析 使用注释及可视化整合分析工具DAVID(https：//david.ncifcrf.gov/)进行养肝方治疗ACLF作用靶点的富集分析,包括基因本体(Gene Ontology,GO)分析和京都基因与基因组百科全书(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)分析。依托R语言绘制出GO功能和KEGG通路富集气泡图、柱状图。

1.1.6关键作用靶点和主要活性成分的分子对接 关键作用靶点蛋白的3D蛋白结构从蛋白质数据库PDB(http：//www.rcsb.org/)中获得。对养肝方有效成分进行两两交集求重复性进行排序筛选,后以生物利用度OB值≥30%,类药性DL≥0.18为筛选条件,分选出养肝方中的主要活性成分,并通过Pubchem(https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)数据库下载其3D结构图。使用AutoDock对蛋白质受体文件和配体文件进行处理,后再进行主要活性成分与关键作用靶点的分子对接。使用PyMOL软件将主要活性成分与关键作用靶蛋白之间的相互作用可视化,并显示为 2D图。

1.2 体内实验验证

1.2.1实验材料与试剂 雄性C57BL/6J小鼠,6-8周龄,购于广东省医学实验动物中心,适应性喂养1周。养肝方(黄芪20 g、绵茵陈30 g、山药15 g、山茱萸10 g、草果10 g、田基黄20 g、焦山楂15 g、砂仁5 g、香附10 g)中药材购自深圳市中医院。SRC(GB111035)、EGFR(GB111504)购买于Servicebio生物技术公司,VEGFA(bs-1313R)、HRAS(bs-1071R)购买于Bioss公司,STAT3(ab68153)购买于Abcam公司。LPS(L4391)、D-galactosamine(G1639)购买于Sigma公司。本实验经中科产业控股(深圳)有限公司动物福利伦理委员会批准,批准号：20220059。

1.2.2动物模型构建及给药 建立肝纤维化小鼠模型,将小鼠随机分为对照组、模型组和养肝方组,每组4只。第1～8周,对照组腹腔注射生理盐水,每周2次;模型组及养肝方组腹腔注射四氯化碳溶液(0.2 mL),每周2次。第9～12周,对照组每周3次腹腔注射生理盐水,模型组每周3次腹腔注射四氯化碳,每天灌胃生理盐水0.6 mL;养肝方组每周3次腹腔注射四氯化碳,每天灌胃养肝方水煎剂0.6 mL。在上述模型构建成功后,小鼠腹腔注射LPS(10 μg·kg-1)和D-Gal(500 mg·kg-1)的PBS溶液(200 mL),24 h后通过腹腔注射麻醉剂(如三溴乙醇类)对小鼠进行深度麻醉,麻醉稳定后对收集小鼠的肝脏进行检测。

1.2.3HE染色 取出肝脏,多聚甲醛固定组织48 h时,梯度乙醇及二甲苯脱水透明后石蜡包埋。切片后用苏木精-伊红进行染色及封片。

1.2.4免疫组化测定组织内蛋白的表达 将石蜡包埋组织切片后依次放入二甲苯及梯度乙醇脱蜡,后放入柠檬酸钠抗原修复液沸水煮20 min以组织修复,将抗原修复后切片置于内源性过氧化物酶阻断剂H2O2并滴加一抗过夜孵育。次日充分洗涤后,切片滴加辣根酶标羊抗小鼠/兔IgG聚合物反应及适量DAB显色剂,5～20 min终止显色并封片。

2 结果

2.1 养肝方治疗ACLF作用靶点的获得通过TCMSP数据库平台及BATMAN-TCM数据库,查找得到养肝方的所有化学成分。其中养肝方有536个化学成分,821个基因靶点。利用疾病数据库,得到1 580个ACLF靶点。通过Venn图取交集,共得到244个交集靶点,即养肝方治疗ACLF作用靶点,见Fig 1。

Fig 1 Venn diagram of drug-disease target intersection

2.2 养肝方治疗ACLF靶点蛋白的PPI网络图及核心靶点蛋白的筛选养肝方治疗ACLF靶点蛋白的PPI网络图见Fig 2,共237个点,2 294条边。选取PPI网络图中,度中心性、紧密中心性及介数中心性均较大的7个蛋白为核心蛋白即AKT1、SRC、VEGFA、STAT3、EGFR、MAPK3、HRAS。养肝方与ACLF交集基因中核心靶点基因的拓扑学参数见Fig 3。

Fig 2 PPI Network diagram of potential target

Fig 3 Core gene screening

2.3 养肝方治疗ACLF作用靶点的GO分析结果GO分析包括细胞组分、分子功能及生物过程的分析,见Fig 4。养肝方治疗ACLF的生物过程主要包括T细胞共刺激、信号转导、DNA模板正转录调控、RNA聚合酶Ⅱ对转录的正调控、平滑肌细胞增殖的正调节等。细胞组分主要涉及转录因子复合物、突触后特化、突触后密度、质膜、磷脂酰肌醇3-激酶复合物。分子功能主要集中在跨膜受体蛋白酪氨酸激酶活性、转录因子结合、支架蛋白结合、RNA聚合酶Ⅱ转录、蛋白酪氨酸激酶活性等。

Fig 4 Visual analysis diagram of biological process, cell composition, molecular function

2.4 养肝方治疗ACLF作用靶点的KEGG分析养肝方治疗ACLF作用靶点的KEGG分析结果见Fig 5。富集显著性较高的通路主要包括：癌症中PD-1和PD-L1检查点信号抑制通路、JAK-STAT信号通路、趋化因子信号通路、C型凝集素受体信号通路等。表明养肝方主要通过以上通路来治疗ACLF。

Fig 5 Visual analysis diagram of KEGG

2.5 养肝方主要活性成分筛选对养肝方536个有效成分的重复性进行排序筛选,再以OB≥30%,类药性DL≥0.18为筛选条件过滤,见Tab 1。其中槲皮素重复性为6,且OB=46.43%,DL=0.28,即选择槲皮素作为后续分子对接的靶点蛋白。

Tab 1 The main active ingredients of JPLSYGF

2.6 槲皮素与核心靶点蛋白分子对接将槲皮素与7个核心靶点蛋白AKT1、SRC、VEGFA、STAT3、EGFR、MAPK3、HRAS进行分子对接,结合能数据依次为-5.9、-8.2、-7.2、-8.2、-8.6、-6.8、-8.8 kJ·mol-1。一般认为,结合能-5.0 kJ·mol-1,表明这种成分与核心靶点蛋白结合性较好,结合能<-7.0 kJ·mol-1,表明此种物质与核心靶点蛋白有很强结合活性。除槲皮素与AKT1、MAPK3的结合能为-5.9、-6.8 kJ·mol-1之外,其余的结合能均<-7.0 kJ·mol-1,说明槲皮素与核心靶点蛋白结合良好。槲皮素与和核心靶点蛋白分子对接示意图见Fig 6。

Fig 6 Molecular docking diagram

2.7 动物实验验证随后我们研究了养肝方是否通过以上核心靶点对ACLF发挥治疗作用。收集小鼠血清进行生化指标检验。Fig 7A、B可见与正常组比较,模型组与养肝方组小鼠血清ALT和AST均升高;且与模型组比较,养肝方组ALT及AST均降低,这说明养肝方对ACLF的肝损伤有保护作用,具有一定的生物安全性。Fig 7C HE染色结果可见,正常组小鼠肝细胞形态正常且连接紧密,结构完整,无炎症细胞细润;模型组小鼠的肝细胞肿胀,肝小叶结构紊乱,炎症及Kupffer细胞浸润(黑色箭头处);养肝方组肝损伤细胞减少,细胞形态较为完整,结构基本正常,炎症浸润程度也明显降低(黑色箭头处)。随后我们对分子对接的结合能均<-7.0 kJ·mol-1的靶点SRC、VEGFA、STAT3、EGFR、HRAS进行免疫组化实验,Fig 7D可见与模型组相比,养肝方均可下调HRAS、EGFR、STAT3、SRC、VEGFA蛋白的表达。

Fig 7 In vivo test

3 讨论

ACLF是一种具有挑战性的疾病,其特征在于不同的临床症状、疾病进展快和高短期死亡率。ACLF通常由细菌感染(35%)、消化道出血(22%)和酒精(19%)引发,病理生理学特征为全身性炎症反应并伴有矛盾的免疫缺陷[6]。这种疾病具有明确的发病机制和流行病学负担,因此临床上需要开发特定和有效的疗法来治疗这种疾病。本研究在前期临床研究中筛选出有效中药方剂养肝方,利用网络药理学策略,系统地研究养肝方治疗ACLF作用的潜在作用靶点和分子机制,并进行动物体内实验验证。

GO富集分析显示,生物过程主要包括T细胞共刺激、信号转导、RNA聚合酶II对转录的正调控等。细胞组分主要涉及转录因子复合物、突触后特化、突触后密度等。分子功能主要集中在跨膜受体蛋白酪氨酸激酶活性、转录因子结合、支架蛋白结合等。ACLF患者常表现出免疫功能障碍,T淋巴细胞功能障碍是ACLF免疫抑制的重要机制[7]。研究发现,ACLF中的T淋巴细胞功能障碍多表现为T淋巴细胞的凋亡增加、增殖能力减弱及反应性降低[8]。KEGG分析显示,富集显著性较高的通路主要包括癌症中PD-1和PD-L1检查点信号抑制通路、JAK-STAT信号通路、趋化因子信号通路、C型凝集素受体信号通路等。PD-1主要在活化的CD8+T淋巴细胞中表达,其配体是PD-L1/PD-L2,PD-L1/PD-L2共刺激信号通路在T淋巴细胞活化、增殖及分泌细胞因子中起重要的负调节作用[9]。Li等[10]发现SOCS3主要通过JAK/STAT3信号通路执行其信号转导中的负调节作用,且其表达水平在HBV-ACLF患者的肝脏组织和PBMC中均显著升高,并与肝损伤程度呈正相关。总结以上研究提示,PD-1/PD-L1信号通路、JAK/STAT信号通路可能在ACLF的发生和发展中起着重要作用。

本研究选取养肝方治疗ACLF的7个核心靶点蛋白中结合能前5的HRAS、EGFR、STAT3、SRC、VEGFA蛋白进行了实验验证。HRAS参与RAS/MAPK途径,负责控制基因转录活动和细胞循环周期,与细胞增殖有关[11]。HRAS蛋白处于持续激活状态时可导致细胞增殖失控[12]。可见模型组HRAS高度活跃,同时养肝方可以下调HRAS表达并可维持正常细胞周期。RAS/MAPK途径也是EGFR下游通路之一,EGFR的过表达或发生突变时,也会导致细胞异常增殖[13]。本实验中模型组可见EGFR高度表达,相反养肝方逆转了这一趋势。SRC作为一种人类普遍表达的蛋白酪氨酸激酶,其异常激活可促进内皮-间充质等过程,将正常细胞转为癌细胞[14]。Du等[15]通过抑制SRC的激活,可阻止肝星状细胞的增殖和迁移,以延缓肝纤维化进程。同样的,养肝方可以抑制SRC的激活,这说明养肝方也可延缓慢性肝病肝脏的纤维化进程。Sole等[16]通过对比研究55名肝硬化患者发现ACLF患者血浆细胞因子中的VEGFA与ACLF关系最显著。肝组织炎症及损伤后模型组VEGFA分泌增加,血管通透性增加,炎症细胞及细胞因子浸润增加,放大了炎症信号,导致血管渗透、水肿及炎症[17]。养肝方可降低体内炎症反应,下调VEGFA表达。促进肝细胞再生是ACLF的重要方面,而STAT3与肝脏促再生途径有关。Xiang等[18]研究发现,IL-6/STAT3通路的破坏会过度激活IFN-γ/STAT1通路导致肝再生能力减弱,STAT3途径的下调有利于ACLF的恢复。这与HE的实验结果一致,同样在本研究中ACLF小鼠表现出显著激活的STAT3信号传导,养肝方下调了STAT3的表达。

综上所述,养肝方具有健脾益气、清利湿热的功效,其可以作用HRAS、EGFR、STAT3、SRC、VEGFA等核心靶点,通过控制细胞增殖、维持细胞周期、抑制内皮-间充质及炎症反应,以达到治疗ACLF的作用。