注射用奈达铂的血管刺激性、溶血性和过敏性试验研究

余 庆，杨文祥*，吴 琳

（1.应用毒理湖北省重点实验室，湖北武汉 430079；2.湖北省疾病预防控制中心，湖北武汉 430079）

0 引言

奈达铂又名顺式-乙醇酸-二氨合铂，是一种广谱的抗肿瘤药。奈达铂适用于头颈部癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、食管癌、膀胱癌、睾丸肿瘤、卵巢癌、宫颈癌等。奈达铂在临床上作为第三代铂类抗肿瘤药，具有水溶性好、毒副作用较小等优势，常用于临床抗肿瘤化疗[1-4]。本试验按照《药物刺激性、过敏性和溶血性研究技术指导原则》[5]的要求，对仿制药注射用奈达铂的安全性进行了评价，为临床安全用药提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 主要药品与试剂

受试制剂：注射用奈达铂（规格：50 mg/支，批号：202104S1，某药业股份有限公司）；参比制剂：注射用奈达铂（Aqulpa）（规格：50 mg/支，批号：HT0100，吉林恒金药业股份有限公司）；溶媒：0.9%氯化钠注射液（规格：100 ml：0.9 g，批号：210507521，武汉福星生物药业有限公司）；鸡蛋清白蛋白（规格：25 g/瓶，批号：KA0418BY14，上海源叶生物科技有限公司）。

1.2 实验动物

Hartley豚鼠，普通级，雌雄各半，体重范围303～387 g，由湖北逸挚诚生物科技有限公司提供，实验动物生产许可证号：SCXK（鄂）2021-0020。日本大耳白兔，普通级，雌雄各半，体重范围2.1～2.7 kg，由湖北逸挚诚生物科技有限公司提供，实验动物生产许可证号为：SCXK（鄂）2021-0020。

1.3 饲养管理条件

豚鼠饲养于本单位普通级豚鼠实验室，实验动物使用许可证号为：SYXK（鄂）2017-0065。日本大耳白兔饲养于本单位普通级家兔实验室，实验动物使用许可证号为：SYXK（鄂）2017-0065。豚鼠和日本大耳白兔实验室相对湿度控制范围均在40%～70%，温度控制范围在18℃～28℃。饲养室每h换气次数8次以上，12 h明/12 h暗循环交替至动物饲养结束。每天喂全价颗粒饲料（武汉市万千佳兴生物科技有限公司），自由饮用自来水。

1.4 耳缘静脉血管刺激性试验

选取日本大耳白兔1 2 只，随机分为受试低剂量组、高剂量组，参比制剂组，每组4只，雌雄各半。注射用奈达铂推荐的临床给药剂量最大值为100 mg/m2，成人体重按70 kg计算，按体表面积公式lgS=0.8762+0.698 lgW[6]，受试制剂低剂量换算成日本大耳白兔给药剂量为2.6 mg/kg，临床最大给药浓度约为0.61 mg/ml，受试制剂高剂量组按照2倍临床给药浓度给药，即1.22 mg/ml，给药剂量为5.2 mg/kg。参比制剂组给予注射用奈达铂（Aqulpa）溶液，剂量同受试制剂低剂量组。采用自身对照，右耳缘静脉注射注射用奈达铂溶液，给药容积为4.3 ml/kg，左耳缘静脉注射等容积0.9%氯化钠注射液，静脉注射速度为20滴/min，给药1次。给药前、给药时、给药后1～2 h和24 h、48 h、72 h、96 h分别对动物和注射部位进行肉眼观察。给药后96 h每组安乐死2只日本大耳白兔，雌雄各1只，剪取双侧兔耳，用4%甲醛溶液固定后，剪取耳缘静脉进针点即A点，进针点靠近近心端方向约3.5 cm处，即B点，进行组织病理学检查，余下动物继续观察到14天，剪取双侧兔耳作病理检查，观察注射部位兔耳缘静脉血管扩张充血、血栓形成、水肿及炎性细胞浸润等改变[6]。

1.5 体外溶血试验

日本大耳白兔红细胞制备：取20 ml日本大耳白兔心脏血，放入含玻璃珠的三角烧瓶中振摇10 min，制备成脱纤血液。随后加入约10倍量的0.9%氯化钠注射液摇匀，1 500 r/min离心15 min，除去上清液，再用0.9%氯化钠注射液洗涤4次沉淀的红细胞，至上清液不显红色终止洗涤，取红细胞1 ml加入49 ml0.9%氯化钠注射液，配成2%红细胞悬液。操作步骤：取12支试管进行编号，1～5号管为受试制剂管，6～10号管为参比制剂管，11号管为阴性对照管，12号管为阳性对照管。按照表1依次加入2%红细胞悬液、0.9%氯化钠注射液或蒸馏水，混匀后立即放置在37℃±0.5℃的恒温箱中进行温育，开始每隔15 min观察1次；1 h后，每隔1 h观察1次，观察3 h。

表1 注射用奈达铂体外溶血试验各个试管各溶液的加入量

结果判定标准：溶液呈澄明红色，管底无细胞残留，可判定为全溶血；红细胞全部下沉，上清液体无色澄明，可判定为无溶血。虽不溶血，但出现棕红色或红棕色絮状沉淀，振荡后不分散，或显微镜下观察凝聚红细胞不能被生理盐水冲散，可判定为凝聚[7]。

1.6 豚鼠主动全身过敏试验

普通级豚鼠40只，随机分成5组，每组8只，雌雄各半，即受试制剂低剂量组（给药浓度为0.61 mg/ml）和高剂量组（给药浓度为1.22 mg/ml）、参比制剂组（剂量同受试制剂低剂量组）、阴性对照组（0.9%氯化钠注射液）和阳性对照组（鸡蛋清白蛋白）。隔日腹腔注射致敏，共3次，致敏给药量0.5 ml/只，阳性对照组为0.5 mg/只。末次致敏后14天，每组雌雄各取前2只经静脉注射进行激发，激发给药量为1.0 ml/只，阳性对照组为1.0 mg/只。末次致敏后21天，剩余动物，再激发。

观察各组动物静脉注射后30 min内的反应及相关症状出现和消失的时间，最长观察3 h，致敏期间每日观察动物的症状，首末次致敏和激发当日测定动物体质量。按全身致敏性评价标准进行评价（见表2），并计算过敏反应发生率。若表现出阳性反应症状，可另取健康未致敏豚鼠2只，注射相同溶液，观察是否出现相同症状，综合考虑进行评价[8]。

表2 过敏反应症状及评价标准

2 试验结果

2.1 耳静脉血管刺激性试验

整个试验过程中，各组试验动物未见明显异常；受试制剂组和参比制剂组兔左耳、右耳给药前，给药时及给药后的各个观察点均未观察到明显的耳缘静脉充血、耳缘红肿等反应。观察14天后也未见明显异常反应。组织病理学检查结果显示，注射给药后96 h处死，在针头经过的试验兔耳静脉的A点主要表现出轻度到中度的血管扩张淤血、少量血栓形成等病理变化；而在注射针头未到达的B点，受试制剂高剂量组3只和参比制剂组2只动物主要表现为血管轻度扩张淤血，其他试验兔静脉未观察到明显异常，表明受试制剂注射用奈达铂未表现出明显刺激性反应。注射后观察14天，在针头经过的试验兔耳静脉的A点主要表现为轻度的血管扩张淤血、少量血栓形成；而在注射针头未到达的部位B点，受试制剂高剂量组1只日本大耳白兔可见血管中度扩张淤血，其他试验兔耳静脉未表现出明显异常，表明受试制剂注射用奈达铂无明显血管刺激性反应。

2.2 体外溶血试验

受制试剂、参比制剂及阴性对照管在各时间点均无溶血，无红细胞凝聚发生；阳性对照管15 min时出现溶血。表明受试制剂注射用奈达铂体外溶血试验对日本大耳白兔红细胞未见溶血和红细胞凝集现象。

2.3 豚鼠主动全身过敏试验

各组动物体重及净增重比较，采用单因素方差分析，结果显示，各组雌雄豚鼠体质量均呈增长趋势，统计学分析无显著性差异（P＞0.05）。

受试制剂、参比制剂及阴性对照组均未见过敏反应症状，致敏率为0。鸡蛋清白蛋白阳性对照组，激发后8只动物，产生过敏反应，全部死亡，致敏率达100%。表明受试制剂注射用奈达铂未引起豚鼠主动全身过敏反应。

3 结论

奈达铂是一种第二代铂衍生物，其肾脏和胃肠道毒性比顺铂低。在临床上，奈达铂导致的过敏反应主要发生在用药24 h内，主要累及血液系统，临床上主要表现为白细胞、中性粒细胞、血小板和血红蛋白减少，其中血小板减少最常见。近年来，临床上有过敏性休克发生的报道。其他常见的不良反应包括骨髓抑制、恶心、呕吐、食欲减退等[9-10]。恶性肿瘤患者化疗后常表现出骨髓抑制的不良反应，骨髓抑制的发生风险会随着药物的积累而增加，因而奈达铂骨髓抑制的不良反应具有剂量限制性毒性的特点[11-12]。

本次研究结果表明，注射用奈达铂在日本大耳白兔血管刺激性试验中未观察到明显刺激性反应，体外溶血试验结果为阴性，豚鼠主动全身过敏试验未见阳性反应。本研究中，注射用奈达铂无血管刺激性、溶血作用以及过敏性，表现出较好的安全性，但临床上有过敏、消化道刺激等不良反应的报道且骨髓抑制为剂量限制性毒性，提示动物试验的结果直接应用到人类过程的具有不确定性，需要我们在动物模型和研究方法等方面进行不断的改进和完善，进而提高动物实验结果应用到临床时的准确性。