高效液相色谱-串联质谱法测定精油类化妆品中生物碱研究

潘广乐

（广州市胜蔻生物科技有限公司，广东 广州 510990）

0 引言

精油类化妆品在经过蒸馏、溶剂提取后，可浓缩获取植物中多种人体有利成分和不利成分。植物精油的沸点范围一般为150～300 ℃，其实际提取过程中会残留一部分生物碱，其中有些生物碱具有一定毒性，如钩吻碱、乌头碱等，因而必须提高精油类化妆品安全问题的相关重视。现有研究中针对化妆品中生物碱测定的研究成果较多，但相关成果大多集中在水剂、乳液膏类化妆品，对于精油类化妆品的研究则相对较少。因此，采用高效液相色谱-串联质谱法对精油类化妆品中生物碱进行检测分析，介绍一种精油类化妆品中生物碱检测方法，将具有一定研究价值。

1 实验仪器与试剂

1.1 实验仪器

液相色谱-串联四极杆质谱仪、超声波清洗器、离心机、快速搅匀器、电子天平等。

1.2 实验试剂

甲醇（色谱纯，分析纯）、乙腈（色谱纯，分析纯）、甲酸（LC-MS 级）、的宁、士延胡索乙素、雷公藤（次碱，吉碱）、青藤碱、秋水仙碱、山梗菜碱、阿托品、麻黄碱、钩吻素子、黄华碱、西伐丁、那可丁、高三尖杉酯碱、东莨菪碱、山莨菪碱、马钱子碱、倒千里光碱、芦竹碱、新/次乌头碱、毛果芸香碱、苯甲酰/苯甲酰新/苯甲酰次乌头原碱、麦角新碱、钩吻素甲、氧化苦参碱、吴茱萸碱、哈尔碱、毒扁豆碱。

2 标准溶液配制

31 种生物碱标准品用电子天平精确称量，放入容量瓶中，用甲醇溶液将其分别定容，制成质量浓度100 mg/L 的标准样品，并将其转入褐色小瓶，在-20 ℃冷藏。

将标样溶液准确地吸入后，将其放入容量瓶中，用质量分数为20%的甲醇溶液进行稀释和定容，制成质量浓度为10 mg/L 的混合标准溶液，并将该溶液转入褐色小瓶，4 ℃低温环境保存。

精确吸取10 mg/L 的混合标准溶液，用的甲醇-水溶液（体积比3∶1）稀释，得到质量浓度为2.5、10、20、50、100、250、500 μg/L 的标准液。另外，吸取10 mg/L 混合标准溶液，采用阴性空白基体萃取液进行稀释和定容，制得质量浓度为2.5、10、20、50、100、250、500 μg/L 的阴性标准溶液。

3 样品前处理及实验条件

3.1 样品前处理

所用的样本都是市场上常用的植物精油。用电子天平精确步骤1.0 g 试样，放入25 mL 带塞比色管中，按3∶1 的体积比将包含2%（体积分数）甲酸溶液的甲醇-水溶液定容至10 mL。先用快速混合机进行1 min 的混合，然后放入超声波设备中萃取10 min，最后用吸管添加正己烷1 mL，用快速混合机处理5 min，除去样本中的脂质。将试样放入离心机，在4 000 r/min 下离心10 min，移除正己烷层，将上清液用0.22 μm 有机滤膜滤出，用LC-MS/MS 对其进行分析。

3.2 实验条件

色谱条件：采用HPH-C18 色谱柱，试验中色谱柱温度控制为35 ℃；色谱流动相A 采用体积分数为0.2%的甲酸水溶液，色谱流动相B 采用乙腈，通过两种流动相对色谱柱实施梯度洗脱，洗脱过程中流动相流速和进样量应分别控制为0.35 mL/min、5 μL。

质谱条件：实验过程中质谱分析方法为正离子扫描、多反应监测等；质谱分析过程中仪器雾化压力控制为276 MPa；设备干燥气通入温度为300 ℃，干燥气流速控制为8 L/min；设备毛细管电压控制为4 000 V。

4 结果与讨论

4.1 色谱-质谱条件优化

质谱条件优化：考虑到生物碱中含有的N 原子上的孤电子易与质子结合，所以实际质谱正离子扫描时将采用一级质谱扫描模式，完成扫描后选用分子离子为母体，实施二级质谱扫描，根据扫描结果选取2 个高丰度、低干扰的子离子作为实验中质谱分析的定量和定性离子，以2 个离子为标准对二级质谱进行优化调整，确保2 个离子响应最大化，由此获取相应的质谱参数。

色谱条件优化：根据现有研究成果（图1）可知，相较于HPH-C18 色谱柱，Bonus-RP 色谱柱的总离子流色谱图中存在多个包峰，说明色谱总体分离效果较差。具体分析后，确认HPH-C18 色谱柱对部分生物碱的键合能力不足，以至于色谱柱分析中出现保留效果不足等情况。不过从整体角度来看，色谱柱分离后总离子流色谱图的峰形较好，应用此色谱柱后可有效增强色谱分析的总体分离度，因而综合分析后选用HPH-C18 色谱柱作为色谱分析色谱柱。

图1 HPH-C18 色谱柱对31 种生物碱总离子流色谱图

4.2 前处理条件优化

提取溶剂优化。分别采用甲醇和乙腈作为提取溶剂，对比分析后确认相较于采用乙腈作为提取溶剂时，采用甲醇作为提取溶剂的响应水平更高，因而选用甲醇作为提取溶剂。当提取溶剂中的有机相为100%时，通过HPH-C18 色谱柱进行色谱分析后发现色谱峰存在明显前延情况，并且得到的色谱峰峰形较差。因此，在对比不同水与甲醇比例条件下样品回收率以及色谱峰形变化后，确认水与甲醇之间的体积比为1∶3 时，通过HPH-C18 色谱柱获取的色谱峰峰形最好，因而将提取溶剂为水与甲醇体积比设置为1∶3。此外，在提取溶剂中加入适量的酸有利于增强生物碱的水溶性，所以在对比提取溶剂中加入不同量甲酸后，确认最佳甲酸添加量为2%（体积分数），此时提取溶液对各种生物碱均有着较高的回收率。

净化条件优化。精油类化妆品中蕴含有较多的油脂类物质，为保障精油类化妆品中生物碱测定精准性，需要在样品前处理过程中对油脂进行有效去除。常用的油脂去除溶剂为正己烷，近年来部分学者采用EMR-Lipid 固相萃取小柱进行油脂类物质去除，为确认两种油脂去除方法的有效性，实施两种方法对油脂去除效果对比，进而获取到图2 中的对比分析结果。根据对比结果可知，相较于正己烷溶剂（HEX 除脂），EMR 固相萃取小柱（EMR 除脂）仅在去除含有5 个以上碳链的脂肪类物质中表现出较好的成效，而精油类化妆品中不含有相关物质，因而为有效降低测定成本，选用正己烷溶剂作为净化溶剂。

图2 两种油脂去除方法的效果对比

4.3 基质效应的评价

基质效应通常会影响测定结果的准确度、灵敏度和准确度。以混合标准溶液作为测定样品，选取阴性标准溶液浓度作为横坐标轴，离子对峰面积为纵坐标轴，根据试验数据绘制相应的基质效应曲线。目前已有多种方法可以对基质效应进行评估，其中基质效应的研究主要是利用基质标准溶液的斜率与基体标准曲线的斜率之比进行。一般认为，SR=100%，不存在基体效应；SR 值在80%～120%范围内（不包括100%），表明有微弱的基质效应；SR 值在50%～80%或120%～150%范围内，表明有中度基质效应；当SR 值＜50%或＞150%时，表明有较强的基质效应。

通过对31 个生物碱类成分的分析，发现其中13%对香精油化妆品基质的作用不大；有52%的生物碱具有中度影响；其中16%的生物碱具有中度影响；19%的生物碱类成分有较强的作用。雷公藤次碱、氧化苦参碱、苯甲酰/次/新乌头碱等具有较强影响。因此，必须采取相应的方法来消除基体的影响。常用的方法有两种，一种是利用标样进行校准曲线修正，另一种是利用内标法对其进行校正。

4.4 线性关系、检出限与定量限

在保障色谱-质谱条件最佳情况下，分别通过不同体积浓度混合标准溶液来测定31 种生物碱的离子对峰面积和质量浓度，并将测定结果分别作为坐标轴的纵坐标、横坐标，根据形成的坐标轴获取31 种生物碱的对应回归方程，相关回归方程的线性相关性系数均处于0.992 9～1.000 0 区间。根据分析结果可知，31 种生物碱在其对应的线性范围内均具备较好的线性关系。将混合标准溶液的质量浓度设定为2.5 μg/L，对31 种生物碱的检出限范围进行分析计算，获得对应的检出限区间为0.11～3.04 μg/kg，31 种生物碱的定量下限区间为0.33～1.13 μg/kg。

4.5 回收率与精密度

以阴性标准溶液为基底溶液，额外添加1 倍、2 倍、3 倍体积浓度的混合标准溶液，充分混合后用于加标回收试验。通过三种浓度溶液分别开展加标回收试验，各重复6 次，获取6 次测试结果后计算每种生物碱的平均回收率均处于63.4%～126.5%，相对标准差处于0.74%～16.81%。总体来说，高效液相色谱-串联质谱法的回收率与精密度均可以满足日常检测标准要求。具体测定结果如表1 所示。

表1 31 种生物碱平均回收率和相对标准差测定结果

4.6 实际样品的检测

随机选取市面上20 种知名精油类化妆品进行检测，确认所检验的20 种化妆品均未检测中上文中31 种禁用生物碱。同时，实验中样品的加标回收率均控制在69.2%～115.6%区间，确认符合质量控制要求。

5 结语

以LC-MS/MS 技术对31 种植物精油中31 种生物碱类成分进行了测定，其中，以含2%甲酸的甲醇-水溶液（体积比为3∶1）为萃取剂，正己烷去油脂，HPH-C18 柱对31 个生物碱成分进行高效分离，经验证，该方法操作简便、快速、准确，能满足31 种植物精油化妆品中禁用生物碱的日常监测需求。