桔梗多糖的制备工艺及生物活性研究进展

孙小雯，杜新颖，付先军，绪扩*，李可建,*

（1.山东中医药大学中医学院，山东济南 250355）

（2.山东中医药大学青岛中医药科学院，山东青岛 266114）

桔梗科（Campanulaceae）植物桔梗[Platycodon grandiflorum(Jacq.) A.DC.]为多年生草本，广泛分布于我国东北、华北、华东、华中等各省份，且在朝鲜、日本、苏联的远东和东西伯利亚地区的南部也有，俗称为“铃铛花”、“灯笼花”、“崂山参”等[1]。桔梗根具有非常高的食用和药用价值，是第一批被国家列为药食两用的中药。其鲜品在我国东北地区常被腌制为咸菜，在朝鲜半岛被用来制作泡菜，当地民谣《桔梗谣》所描写的植物就是桔梗。桔梗的药用记载最早可追溯于《神农本草经》，被列为中品，苦、辛、平，归肺、胃归肺经，《珍珠囊药性赋》记载其“利膈气，仍治肺痈；一为诸药之舟楫；一为肺部之引经”。2020 版《中国药典》记载：桔梗具有“宣肺，利咽，祛痰，排脓”之功效。中医临床用于治疗咳嗽痰多，胸闷不畅，咽痛音哑，肺痈吐脓等病症。

现代研究表明，桔梗中含有五环三萜类、黄酮类、多烯炔类、酚酸类等化学成分；而齐墩果烷型五环三萜皂苷类（如桔梗皂苷D）是桔梗的特色成分，普遍被认为是其功能性成分之一，具有抗炎、抗肿瘤、抗菌、保肝等药理活性[2]。除小分子成分外，桔梗中还含有丰富的多糖、蛋白质等生物大分子成分，其中所含的水溶性多糖含量可达10%，此类成分在抗炎和免疫调节等方面也发挥着至关重要的作用，目前已有众多研究论文发表。据我们所知，当前国内还尚有针对桔梗多糖的文献综述。本文通过系统梳理国内外桔梗多糖提取、分离纯化以及生物活性等方面的相关研究，对桔梗多糖的最新研究进展进行系统归纳和总结，旨在为桔梗多糖的研究开发和利用提供参考。

1 桔梗多糖的制备工艺

1.1 提取

通过调研文献，我们发现桔梗多糖的提取以常规方法为主，包括：水提法、超声辅助提取法、微波辅助提取法、以及复合酶提取法，个别使用酸、碱辅助提取法[3]。由于多糖良好的水溶性特性，水提法也是其它3 种多糖提取方法的基础。超声波辅助提取法利用超声波的热效应、机械效应和空穴效应破坏细胞壁，释放细胞中的多糖从而提高提取效率。而微波辅助提取法则是利用了微波的加热效应和生物破壁效应，快速溶解多糖并扩散至细胞外，具有提取快速、高效清洁的优点。此外，在已发表研究论文中，大多采用了单因素考察、正交实验和响应面设计等基本的工艺设计，考察的参数包括提取的料液比、提取温度和提取时间等。在已报道的提取工艺中，桔梗多糖的提取得率（按桔梗药材干重计）最高为：5.85%[4]，最低为3.51%[5]。另外，向丽[6]研究了以复合酶提取桔梗多糖的可行性，当酶配比纤维素酶用量2.0%、半纤维素酶用量2.5%、木瓜蛋白酶用量2.0%、酶解时间90 min、温度50 ℃pH 值5.30，桔梗多糖的提取率可达5.64%。

1.2 分离纯化与结构分析

1.2.1 分离纯化

多糖结构十分复杂，为了获得均一的桔梗多糖，需要去除粗多糖中的杂质，主要包括色素、蛋白质、小分子物质、单糖、无机盐等物质，而在所有杂质中，色素和蛋白质对于多糖的结构分析及生物活性研究影响最大[7]。脱色素主要采用的石油醚，或者是高浓度的醇溶液，保证杂质溶解而多糖不溶解，从而减少损失。传统脱蛋白方法主要包括Sevage 试剂法、三氯乙酸（Trichloroacetic Acid，TCA）法、蛋白酶水解法等，新型脱蛋白方法主要有冻融法、双醛纤维素法、磁性壳聚糖微球法、CaCl2法、树脂吸附法和醋酸铅法。王世佳等[8]通过设计实验，比较了Sevage 法、盐酸法、三氯乙酸法、酶法以及酶与Sevage 结合法，这五种方法的脱蛋白效率，最终研究结果表明三氯乙酸法蛋白质的清除率最高，多糖的损失率最小。华芳等[9]研究了活性炭脱色的工艺，得出最佳桔梗粗多糖的最佳脱色工艺为2%活性炭，80 ℃水浴脱色30 min。去除杂质后的中药粗多糖仍是由很多分子量、结构不同的多糖混合而成。仍需进一步对其进行分离纯化，才可得到均一性多糖。目前多糖的主要分离和纯化方法主要包括乙醇沉淀、透析、柱色谱和离子交换色谱法[10]。通过调研文献，我们发现用于桔梗多糖分离纯化最多的方法是DEAE-52 离子交换柱层析和Sephadex 柱层析技术（表1）。

表1 桔梗多糖常见分离纯化工艺流程Table 1 Common separation and purification process of Platycodon grandiflorum polysaccharide

表2 文献中已报道的桔梗单一多糖Table 2 Single polysaccharide of Platycodon grandiflorum reported in the literature

1.2.2 结构分析

据前期文献调研，当前从桔梗中分离纯化到的多糖约20 多个，其分子量最小为1 900 u，最大为440 000 u；以中性多糖为主，包含的单糖主要有果糖、葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖、鼠李糖、甘露糖，生物活性评价方面主要测试了其抗氧化活性、抗哮喘活性和抗肿瘤活性。

2 桔梗多糖的生物活性研究

2.1 抗炎与免疫调节

抗炎是桔梗多糖的主要生物活性。盛瑜[11]通过回流提取法提取桔梗多糖灌胃给药，结果表明桔梗多糖可显著抑制哮喘大鼠细胞因子Eotaxin-1 和细胞间黏附分子（Intercellula Cell Adhesion Molecule，ICAM）-1 表达，减少嗜酸性粒细胞，抑制炎性细胞、细胞因子、炎症介质的释放，降低哮喘大鼠血清、支气管肺泡灌洗液中白细胞介素（Interleukin，IL）-4 含量，升高干扰素（Interferon，IFN）-γ含量，调节Th1/Th2 平衡，同时体外实验证明桔梗多糖可抑制人气道平滑肌细胞的增殖，抵制气道重建。姚欢欢等[25]回流提取桔梗多糖灌胃给药，发现可以通过降低炎性细胞的产生来缓解小鼠哮喘的发作，减轻炎性反应，降低血清免疫球蛋白IgE 水平、肺组织内蛋白转化生长因子（Transforming Growth Factor，TGF）-β1、平滑肌肌动蛋白（α-SMA）、细胞周期蛋白（Cyclin D1、Cyclin D2）表达，延缓气道重塑。Li 等[26]采用热水提取后分离纯化的两种桔梗多糖（PRP1 和PRP2）按比例3.2:1 混合为细多糖PRP，并通过体内外实验表明PRP 可通过抑制miR-181a 和转录激活Hippo 和SIRT1 通路，抑制呼吸道合胞病毒诱导的细胞凋亡并保护小鼠免受该病毒诱导的肺部炎症。

此外，刘杨等[27]用热水提取的桔梗粗多糖干预溃疡性结肠炎模型小鼠，发现桔梗多糖能通过抑制髓过氧化物酶（Myeloperoxidase，MPO）活性和炎性反应，减少炎性细胞浸润，下调肿瘤坏死因子（Tumor Necrosis Factor，TNF）-α、IL-1β表达，上调IL-10 表达，提高小鼠结肠组织及血清中超氧化物歧化酶（Super Oxide Dismutase，SOD）活性，降低丙二醛（Malonaldehyde，MDA）水平，缓解体内氧化应激水平，从而发挥其抗炎作用。

桔梗多糖还可通过刺激免疫细胞、调节细胞因子的释放、促进抗体的分泌等来调控动物机体的免疫系统。Liu 等[28]基于肺肠相关理论发现桔梗多糖大分子可能通过小肠和肺之间的共同粘膜免疫调节肺免疫状态。Zhao 等[29]通过水提取和醇沉淀法制备了三种桔梗粗多糖（PGPS60、PGPS80、PGPSt），通过体外实验研究表示桔梗多糖能促进淋巴细胞的增殖活性，促使淋巴细胞周期从G0/G1期进展到S 期和G2/M 期，提高CD4+T、CD8+T淋巴细胞百分率及CD4+/CD8+比值，来增强细胞免疫功能。Zheng 等[30]使用上述同样桔梗粗多糖经过体外试验发现其在15.625 µg/mL 时，可以有效激活鸡腹腔巨噬细胞，诱导上调细胞表面因子CD80 和CD86 的表达，并产生NO、TNF-α、IL-1β、IL-6，显著调节鸡腹腔巨噬细胞的免疫功能和生物活性。此外，由线粒体介导细胞凋亡占肺泡巨噬细胞凋亡的很大部分，Wang 等[31]实验发现PGPSt可以拮抗羰基氰化物间氯苯腙（Carbonyl Cyanide m-Chlorophenylhydrazone，CCCP）诱导的凋亡相关蛋白表达，抑制细胞凋亡，其机制可能与桔梗多糖维持正常线粒体膜电位、上调半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶（Cysteinyl Aspartate Specific Proteinase，Caspase）-9 和B 细胞淋巴瘤-2（B Cell Lymphoma，Bcl-2）蛋白表达以及下调Caspase-3 表达的能力有关。王成[32]实验发现PGPSt浓度在200 μg/mL 时对CCCP 引起的猪肺泡巨噬细胞损伤具有保护作用，其机制可能是通过促进细胞增殖，恢复线粒体膜电位，调节相关凋亡蛋白表达等实现。并且桔梗多糖诱导的自噬可以抑制猪肺泡巨噬细胞凋亡并促进细胞生长，其中PI3K/Akt/mTOR 途径发挥了关键作用[33]。李丽萍[34]发现PGPSt可通过PI3K/Akt/mTOR和MEK/ERK 通路诱导细胞自噬，且通过自噬降解细胞因子信号传导抑制因子1/2 蛋白促进猪肺巨噬细胞M1 型极化。

2.2 抗肿瘤活性

植物多糖抗肿瘤机制可以抑制肿瘤细胞生长、增强免疫调节、抑制肿瘤细胞侵袭和转移三个方面实现[35]。陆文总等[36]使用热水提取获得的桔梗多糖对通过体外研究发现，桔梗多糖可显著抑制HeLa 癌细胞的生长，且还可通过上调p19ARF和Bcl-2 相关X 蛋白（Bel-2 Assoeiated Protein X，Bax）蛋白，下调突变型p53 蛋白表达以抑制U-14移植瘤生长，从而诱导癌细胞发生凋亡[37]。王菊等[38]通过桔梗多糖灌胃给药S180 荷瘤小鼠，发现胸腺及脾脏指数、淋巴细胞增殖刺激指数及NK 细胞活度、IL-2 及IFNγ明显上升，toll 样受体（Toll-Like Receptors，TLR）4、髓样分化因子88（Myeloiddifferentiationfactor88，MyD88） 及核因子-κB（Nuclear Factor-κB，NF-κB）蛋白表达水平明显降低，这与抑制肿瘤生长和改善机体免疫功能相关。黄晓东[39]经体外实验发现通过桔梗多糖的调控，肿瘤细胞的促凋亡因子Bax 表达水平上升，抗凋亡因子Bcl-2 表达水平下降，线粒体依赖的Caspase-3 表达上调，引起凋亡信号通路激活，进而诱导人结直肠癌细胞系HT-29 细胞凋亡。He 等[23]通过体内外实验评价了通过热水提取分离纯化出的两种桔梗多糖（PRP1 和PRP2）对肝癌的肿瘤生长抑制作用，其中PRP1 的作用更为显著，PRP1 通过下调miR-21和激活PTEN 来抑制HepG2 细胞的增殖。

Park 等[40]通过体内外实验表明，桔梗多糖通过激活TLR4 下游的促分裂素原活化蛋白激酶（Mitogen-Activated Protein Kinase，MAPK） 和NF-κB 信号，诱导树突状细胞（Dendritic Cell，DC）成熟，而成熟的DC 表达高水平的主要组织相容性复合体-I/II、共刺激分子和细胞因子，导致T细胞激活，因此桔梗多糖可能被用作以DC 为基础的癌症免疫治疗佐剂。

植物多糖经过改善理化性质和空间结构，还可进一步增强其生物活性[41]。Zhang 等[21]将桔梗多糖（PGP40-1）通过HNO3/Na2SeO3方法修饰为硒化桔梗多糖（Se-PGP40-1），而Se-PGP40-1 比PGP40-1的抗肿瘤活性更为显著，可通过诱导细胞凋亡，阻断血管生成以抑制肿瘤增殖和迁移。

2.3 抗氧化活性

生物氧化可以为人类活动提供能量，而氧化产生的自由基分解细胞和组织，影响人体新陈代谢。但过多的自由基会对人体的正常细胞和组织造成损害，导致多种疾病，如常见癌症、动脉硬化、糖尿病、白内障、心血管疾病、阿尔茨海默病、关节炎等[42]。而桔梗多糖对羟基自由基离子（·OH）及超氧阴离子（O2-）均有明显的清除能力[43]。

于侃超等[44]分析了四种不同提取方法对桔梗多糖抗氧化能力的影响，发现微波法和复合酶法体外抗氧化活性强于超声波法和热水法，其中微波法的抗氧化能力最强。杨晓杰等[45]用热水提取法提取后分离纯化5 个桔梗多糖分组，对其进行抑菌和抗氧化研究，结果显示对细菌均无抑制作用但在浓度为200 mg/mL 时对真菌抑制效果最强，并且发现桔梗多糖清除·OH 的能力大于O2-，且未脱蛋白的多糖对·OH 的清除率更高。董增等[46]采用热水溶解-乙醇沉淀的方法提取桔梗粗多糖，后经分离纯化得到一种纯多糖，对比二者的体外抗氧化性，发现纯多糖在对于ABTS+、·OH 和DPPH 自由基清除上优于粗多糖但Fe2+螯合能力和还原能力弱于后者。Zou等[17]通过离子交换色谱和凝胶过滤从桔梗根中提取一种果胶多糖（PGP-I-I）并通过体外抗氧化性研究发现PGP-I-I 可通过促进细胞抗氧化基因的表达，在过H2O2处理条件下恢复肠细胞抗氧化防御，并保护其免受氧化损伤。Sheng 等[47]从桔梗中分离出一种硒多糖可以显著抑制H2O2诱导的褐家鼠肾上腺嗜铬细胞瘤细胞氧化损伤，可能被认为是通过抑制氧化应激来减少神经元氧化损伤的潜在有用的抗氧化剂。

此外，桔梗多糖进行化学修饰后得到的纳米硒-桔梗多糖，对于O2-·、·OH、DPPH·均有良好的清除作用，且清除率在实验范围内随浓度增加而上升，半数抑制率分别达到1.72、3.19、6.76 mg/mL[48]。

2.4 降血糖活性

桔梗多糖可降低糖尿病大鼠血糖水平，其机制可能与改善胰岛素抵抗、脂代谢水平、提高抗氧化能力有关。乔彩虹等[49]采用腹腔注射链脲佐菌素（Streptozotocin，STZ）建立1 型糖尿病大鼠模型，发现灌胃从低到高桔梗多糖后，成剂量依赖性抑制空腹血糖（Fasting Blood Glucose，FBG）、增加空腹胰岛素水平（Fasting Iisulin，FINS）水平及胰岛素敏感指数（Insulin Sensitivity Index，ISI），并且通过降低SOD、增加MDA 提高抗氧化能力。赵凯迪等[50]采用高脂喂养联合腹腔注射STZ 建立2 型糖尿病大鼠模型，发现总胆固醇（Total Cholesterol，TC）、甘油三酯（Triglyceride，TG）、低密度脂蛋白（Low Density Lipoprotein Cholesterol，LDL-C）、MDA 水平显著下降，高密度脂蛋白（High Density Lipoprotein Cholesterol，HDL-C）、SOD、谷胱甘肽（Glutataione，GSH）、过氧化氢酶（Catalase，CAT）水平显著上升（P＜0.05），且所有指标均呈剂量依赖性。侯巍等[51]通过监测小鼠体质量、饮食饮水量、FBG 变化以及测定小鼠血清谷胱甘肽过氧化物酶（Glutathione Peroxidase，GSH-Px）活性和MDA含量，发现纳米硒桔梗多糖复合物对糖尿病小鼠有显著的降糖效果。

2.5 肝保护活性

桔梗多糖还具有一定的肝保护活性。侯巍等[52]用维生素C 还原法制备纳米硒桔梗多糖复合物，通过灌胃给药对比纳米硒桔梗多糖复合物与桔梗多糖对肝损伤小鼠的保护作用，发现谷丙转氨酶（Alanine Transaminase，ALT）、 谷草转氨酶（Aspartate Transaminase，AST）、碱性磷酸酶（Alkaline Phosphatase，ALP）、GSH-Px 活力和MDA 含量显著降低，而总蛋白（Total Protein，TP）和白蛋白（Albumin，ALB）含量显著升高，而疗效最好均为高剂量纳米硒桔梗多糖复合物组。此外，Qi 等[53]通过对急性肝损伤小鼠灌胃PGPSt，发现可下调裂解的Caspase-3 和Bax，上调Bcl-2 蛋白表达，阻断脂多糖和TLR4 的结合，抑制NF-FB和MAPK 信号通路的激活，以证明其对急性肝损伤的肝保护机制。蔡妍玮等[54]通过提取纯化得到桔梗精多糖，采用体外细胞实验证实其通过促进LINC01554 的表达抑制肝癌细胞增殖、克隆形成能力及促进肝癌细胞凋亡。

2.6 其它活性

近年来，关于桔梗多糖的研究越来越广泛，除了上述作用及机制外（见图1），桔梗多糖还具有缓解铬引起的线粒体损伤及线粒体自噬[55]、抗疲劳、抗病毒和调节肠道微生物等作用。杨晓杰等[56]发现在桔梗多糖质量浓度为0.8 mg/mL 对小鼠的抗疲劳作用最佳。Xing 等[57]用猪肾贴壁细胞建立伪狂犬病病毒感染模型发现，桔梗多糖可以激活Akt-mTOR信号通路，抑制病毒诱导的自噬，进而抑制病毒的复制，发挥体外抗病毒作用。此外，Shan 等[20]从桔梗根中提取的菊粉型果聚糖可以在一定程度上改善PM2.5 暴露导致的肠道微生物群失衡。

图1 桔梗多糖药理作用机制Fig.1 Pharmacological mechanism of Platycodon grandiflorum polysaccharides

3 结论与展望

桔梗作为药食两用的大宗中药材品种，在食品及药品行业中均有大量应用。现代研究表明皂苷类成分是桔梗的主要活性成分，围绕桔梗成分的相关研究也多是针对皂苷类物质开展，而对桔梗多糖的关注度不够。本文通过系统归纳国内外文献，首次针对桔梗多糖进行文献综述，发现当前对桔梗多糖的研究仅停留于提取和分离工艺的优化阶段，得到的高纯度多糖不多，鉴定出结构的仅二十余个，这与桔梗粗多糖的含量及种类相比，仅占相当小的比重。对桔梗多糖的生物活性研究，主要聚焦于抗炎与免疫调节以及抗肿瘤活性方面，现有数据表明桔梗多糖具有重要的研究意义。展望未来，应进一步加强对桔梗均一多糖的分离纯化研究，并对其开展全面的体内外药效评价及深入的作用机制研究，以期进一步揭示桔梗的功能性物质成分，促进桔梗的深度开发利用研究。