血清miR-31、IL-22 联合检测在儿童病毒性心肌炎诊断及预后评估中的价值

李莹莹 姚晓利 郑瑞利 何坤

病毒性心肌炎（Viral myocarditis，VMC）是由流感病毒、柯萨奇病毒及腺病毒等病毒感染引起心肌组织炎症反应，导致心肌细胞代谢功能异常，进而引起心律失常、心源性休克及心力衰竭等严重后果［1］。目前临床上对于VMC 诊断的金标准为心肌活检，但心肌活检存在技术难度高、创伤大等问题，不能在临床上广泛应用，而心肌生物标记物检测则因为操作方便而备受临床关注［2］。微小RNA-31（microRNA-31，miR-31）是一种非编码链RNA 分子，通过与靶基因mRNA 结合，能够调控基因转录后的表达水平，进而调控细胞增殖、分化与凋亡，且在免疫反应和炎症反应等进程中具有重要作用［3］。白细胞介素-22（Interleukin-22，IL-22）是由免疫细胞分泌的一种细胞因子，能够调节炎症反应、维持稳态、免疫反应及组织修复等，在心肌炎、动脉粥样硬化及心肌梗死等多种心血管疾病的发生发展过程中具有重要作用［4］。本研究通过分析血清miR-31、IL-22 联合检测在儿童VMC 诊断及预后评估中的价值，为临床诊治提供参考意见。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2017 年1 月至2022 年1 月河南省儿童医院心血管内科收治的106 例VMC 患儿，将其命名为VMC 组，平均年龄（6.34±1.46）岁；男性59 例，女性47 例。纳入标准：①均符合病毒性心肌炎的相关诊断标准［5］；②年龄≤14 岁；③临床资料基本完整。病例排除标准：①合并存在先天性心脏病或其它类型心肌炎者；②合并存在遗传代谢性疾病者；③合并存在严重感染性疾病者；④近期存在心脏疾病手术史者；⑤近期存在使用免疫抑制剂、干扰素及血液制品治疗者。另选70 名同期在本院体检的健康儿童作为对照组，平均年龄（6.68±1.54）岁；男性40 例，女性30 例。本研究已获取医院伦理委员会审查批准，所有参加研究儿童的监护人均签署知情同意书。

1.2 心电图与超声心动图检测

采用多导联心电分析系统对两组进行心电图检测，记录心室除极时间，即QRS 间期；记录P 波终点至QRS 波群起点的时间间隔，即PR 间期。

采用彩色多普勒超声诊断仪对两组进行超声心动图检测，参数设置：频率4 MHz，帧频60/s。记录左室射血分数（Left ventricular ejection fraction，LVEF）与左心室短轴缩短率（Left ventricular fractional shortening，LVFS）。

1.3 血清指标检测

于清晨下采集两组的静脉血5 mL，在5 000 r/min（4℃，半径10 cm）下进行离心15 min 后，将上层血清置入-80℃冰箱保存待检。①miR-31 检测：以荧光定量聚合酶链式反应法检测血清miR-31 的表达水平。以Trizo 试剂盒（赛默飞世尔科技（中国）有限公司）提取血清的总RNA，以反转录试剂盒（上海沪震生物科技有限公司）进行反转录合成cDNA，相关反应条件如下：90℃变性30 s；60℃退火40 s；70℃延伸60 s，共30 个循环。引物序列如下：F：5′-CAGGCACGCTGCGGACAGCCA-3′；R：5′-TGGTGCAGTGCAGCCGAGGT-3′。根据2-ΔΔCt法计算miR-31 的相对表达量。②IL-22 与肌酸激酶同工酶检测：以酶联免疫吸附法检测血清IL-22与肌酸激酶同工酶（Creatine kinase isoenzyme，CK-MB）水平，按照试剂盒（武汉赛培生物科技有限公司）说明书进行检测操作；③心肌肌钙蛋白Ⅰ检测：以免疫化学发光法检测血清心肌肌钙蛋白T（Cardiac troponin T，cTnT）水平，按照试剂盒（上海科华生物工程股份有限公司）说明书进行检测操作。

1.4 调查方法

在治疗结束后以门诊定期复查或电话联系等方法对VMC 患儿进行随访，每3 个月随访1 次，时长为1 年。以随访期间发生恢复迁延、扩张性心肌病、遗留心律失常及患儿死亡等事件为预后不良，随访截止时间为2023 年1 月或患儿出现死亡，结果显示，预后良好的患儿为78 例，预后不良的患儿为28 例。收集可能对VMC 患儿预后存在影响的因素，包括年龄、性别、血清miR-31、IL-22、CK-MB、cTnT 水平及QRS 间期、PR 间期、LVEF 与LVFS 等相关信息。

1.5 统计学方法

以SPSS 22.0 统计学软件进行数据分析。符合正态分布的计量资料以（）表示，采用独立样本t检验；计数资料以n（%）表示，采用χ2检验；采用多因素Logistic 回归分析影响因素；采用受试者工作特征（ROC）曲线分析血清miR-31、IL-22 水平对VMC 患儿诊断及预后不良评估的价值，以P＜0.05 表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组血清指标与心电图、超声心动图参数比较

VMC 组的血清miR-31、IL-22、CK-MB、cTnT水平及QRS 间期、PR 间期均高于对照组，LVEF、LVFS 均低于对照组差异均具有统计学意义（P＜0.05）。见表1。

表1 两组血清指标与心电图、超声心动图参数比较（）Table 1 Comparison of serum indexes，electrocardiogram and echocardiogram parameters between the two groups（）

表1 两组血清指标与心电图、超声心动图参数比较（）Table 1 Comparison of serum indexes，electrocardiogram and echocardiogram parameters between the two groups（）

2.2 血清miR-31、IL-22 对VMC 诊断的预测价值

ROC 曲线显示，血清miR-31、IL-22 水平二者联合检测对VMC 诊断高于单一检测（P＜0.05）。见表2、图1。

图1 血清miR-31、IL-22水平对VMC诊断的ROC曲线分析Figure 1 ROC curve analysis of serum miR-31 and IL-22 levels for VMC diagnosis

表2 血清miR-31、IL-22 对VMC 诊断的预测价值Table 2 Predictive value of serum miR-31 and IL-22 in diagnosis of VMC

2.3 VMC 患儿预后单因素分析

对影响VMC 患儿预后不良的因素进行分析，miR-31、IL-22、CK-MB、cTnT、QRS 间期、PR 间期、LVEF 及LVFS 均是VMC 患儿预后不良的影响因素，差异均有统计学意义（P＜0.05）。见表3。

表3 VMC 患儿预后单因素分析［n（%），（）］Table 3 Univariate analysis of prognosis in children with VMC［n（%），（）］

表3 VMC 患儿预后单因素分析［n（%），（）］Table 3 Univariate analysis of prognosis in children with VMC［n（%），（）］

2.4 VMC患儿预后不良的多因素Logistic回归分析

以VMC 患儿是否出现预后不良为因变量，将收集的基本资料为自变量进行Logistic 回归分析。结果显示，miR-31 水平高表达、IL-22 水平升高、CK-MB 水平升高、cTnT 水平升高、QRS 间期延长、PR 间 期延长、LVEF降低及LVFS 降低均 是VMC 患儿预后不良的独立危险因素。见表4。

表4 VMC 患儿预后不良的多因素Logistic 回归分析Table 4 Multivariate Logistic regression analysis of poor prognosis in children with VMC

2.5 血清miR-31、IL-22 水平对VMC 患儿预后不良的预测价值

ROC 曲线显示，血清miR-31、IL-22 水平联合的预测价值高于单一检测（P＜0.05）。见表5、图2。

图2 血清miR-31、IL-22 水平对VMC 患儿预后不良的ROC 曲线分析Figure 2 ROC curve analysis of serum miR-31 and IL-22 levels on poor prognosis in children with VMC

表5 血清miR-31、IL-22 水平对VMC 患儿预后不良的预测价值Table 5 Predictive value of serum miR-31 and IL-22 levels for poor prognosis in children with VMC

3 讨论

VMC 具有多种表现形式，在急性期病毒被清除后，患者仅表现为疲劳和呼吸短促等非特异性症状，但病毒感染持续存在可能会引起自身免疫介导的持续性炎症反应，严重的情况下会发生暴发性心肌炎，导致病情迅速进展，具有较高的死亡率［6］。宋微等［7］研究认为，VMC 与病毒直接损伤心肌组织、机体自身的免疫反应、遗传因素和氧化应激反应作用等因素相关，机体在受到病毒感染后，能够激活炎症信号通路清除病毒，但同时会促进大量炎症因子分泌，放大炎症反应，进而造成心肌组织损害。Xia K 等［8］研究指出，VMC 在儿童的发病率呈上升趋势，心肌细胞的慢性炎症可引起心肌细胞生长抑制、肥大、凋亡和心肌纤维化，从而引起扩张性心肌病和心力衰竭，如果诊断和治疗不及时，会严重影响VMC 患儿的预后。因此，寻找有效的VMC 诊断标志物

对患儿的临床治疗和预后具有积极意义。microRNA 是一种长约20～25 个核苷酸的单链RNA 分子，能够调节靶基因的表达参与调控心肌细胞凋亡与炎症反应、调节宿主免疫机制以及影响病毒感染的过程等多种方式影响VMC 的进展，在VMC 生理病理的发展过程中具有重要作用［9］。miR-31 是microRNA 家族成员，Climent M 等［10］研究表明，miR-31 参与调节机体的氧化应激反应，促使心肌细胞凋亡。陈策等［11］研究指出，miR-31 能够调节炎症反应参与VMC 的发病机制，其表达水平与VMC 的病情密切相关，而且miR-31 通过参与调节免疫细胞，影响调节性T 细胞的分泌，进而影响VMC 的病理过程。本研究结果提示miR-31可以作为诊断VMC 的指标。IL-22 是一种重要的促炎介质，具有调节免疫应答、抗微生物感染以及促进组织修复等多种作用，与心肌细胞的炎症反应相关［12］。吉思等［13］研究表明，IL-22 与心脏炎症和心肌细胞凋亡密切相关，进而参与VMC 的发生发展过程。王芳娟等［14］研究指出，VMC 的发生与病毒引起的免疫反应异常都和心肌细胞损伤相关，而IL-22 参与病毒对机体VMC 的直接损伤，导致病情的发生发展。本研究结果提示IL-22 可以作为诊断VMC 的指标。

本研究采用多因素Logistic 回归分析了对VMC 患儿预后不良的相关影响因素，结果显示，miR-31 水平高表达、IL-22 水平升高、CK-MB 水平升高、cTnT 水平升高、QRS 间期延长、PR 间期延长、LVEF 降低及LVFS 降低均是VMC 患儿预后不良的独立危险因素，了解相关危险因素对减少VMC 患儿预后不良情况发生具有积极意义。毛柳青等［15］研究认为，CK-MB 水平升高与心肌细胞受损密切相关。丁佩芳等［16］研究指出，cTnT 是心肌细胞的标志物之一，当心肌细胞受损后，游离的cTnT 进入血液循环，从而表现为血清cTnT 水平上升。卢志强等［17］研究表明，VMC 导致了传导系统与心室肌除极的延缓以及室内传导阻滞，导致QRS 间期与PR 间期延长，而且心肌损伤会影响心肌纵向运动下降，导致LVEF 与LVFS 降低。本研究进一步验证血清miR-31、IL-22 水平对VMC 患儿诊断及预后不良评估的预测价值，ROC 曲线分析表明，各单一指标均可对VMC 患儿诊断及预后不良进行预测，提示血清miR-31、IL-22 水平可作为VMC 患儿诊断及预后不良的诊断指标，且联合检测的敏感度和特异度更高。

综上所述，miR-31、IL-22 在病毒性心肌炎患儿血清中呈高表达，可能成为儿童病毒性心肌炎诊断及预后评估的辅助预测指标。