基于动物实验系统评价大黄素治疗糖尿病肾病的可行性

何 望，黄国顺，张凯钰，周恩超

（1.南京中医药大学附属医院，江苏 南京 210029；2.江苏省中医院，江苏 南京 210029）

由于糖尿病的发病率和患病率在全球持续增加，糖尿病肾病（diabetic kidney disease，DKD）的患者也随之增加，总体增加的病例数量对糖尿病肾病的进展产生了极大的影响［1］。DKD 是糖尿病患者常见的并发症［2］，在我国，糖尿病人群居世界首位，人数已超1 亿，而在欧美发达国家，DKD 发病率随着生活环境、饮食结构的改变等各种原因，也呈逐年上升趋势，近几年更是达到了顶峰。有报道称，在美国，大约30%～40% 的糖尿病患者发生DKD［3］，DKD 成为除肾小球肾炎外导致终末期肾病（ESRD）的主要病因［4］。DKD 在早期通常以微量白蛋白尿为临床表现，随着病情的发展变化，肾功能也会逐渐出现异常［5］。DKD 的发病机制多样且复杂，尽管没有完全阐明，但有学者提出了血流动力学异常、炎症介质、血脂紊乱等学说［6］，其中足细胞损伤、Nephrin 的异常表达已被认为是关键因素。足细胞位于肾小球毛细血管外的肾小球基底膜上，而Nephrin 是一种主要的足细胞细胞骨架蛋白和狭缝隔膜结构蛋白，当足细胞损伤，Nephrin 表达异常时，肾小球滤过膜的完整性遭到破坏，蛋白尿也随之产生［7］。目前，DKD 的临床治疗较为单一，缺乏针对性更强，有效性更佳的治疗手段。大黄素（emodin，EM） 是蓼科植物掌叶大黄（Rheum palmatumL）、唐古特大黄（Rheum tanguticumMaxim.ex Balf）和药用大黄（Rheum offcihaleBaill）的有效活性成分，属于蒽醌类化合物，具有抑菌、抗炎、调节免疫、抗肿瘤、改善肾功能等药理作用［8］，但其具体作用机制尚在研究中。本研究以Meta 分析为探究方法，以动物实验为研究基础，探讨大黄素保护肾脏的相关理论。

1 资料与方法

1.1 资料来源与检索策略

两名研究者（黄国顺，何望） 用中文检索词“大黄 素”、“大 鼠”、“小 鼠”、“动 物 模 型”“实 验”、“肾病”、“糖尿病”、“糖尿病肾病”为主题词分别检索中文数据库：中国学术期刊全文数据库、万方数据库、中文科技期刊数据库 ，中国生物医学文献数据库；以“archen or emodin” and “diabetic nephropathy or diabetic”为检索公式检索PubMed、The Cochrane Library、Web of science 数据库，检索时间为建库至2023 年2 月25 日。

1.2 纳入及排除标准

关于大黄素保护糖尿病鼠肾脏的动物实验研究均被纳入； 排除结局指标不包括主要结局指标之一的研究，非动物实验研究（如综述类文章等），雷同研究及大黄素类似物的研究。

1.3 资料提取

由2 名研究员（何望、张凯钰）根据纳入和排除准筛选文献，提取内容包括纳入研究的一般情况（包括作者、年龄等）；动物基本情况（大/小老鼠、种属等）；实验方法（大黄素浓度、造模方式等），反映研究质量指标；完成后交叉核对，若两人意见不统一，则通过团队其他成员共同讨论，协助判断。

1.4 评价与分析

采用动物实验偏倚风险评估工具（ the systematic re- view centre for laboratory animal experimentation，SYRCLE）［9］。选用RevMan 5.4 统计分析：（1）Chi2 检验进行异质性分析，效应量以95%CI表示，固定效应模型适用于异质性较小的情况（P＞0.1，I2＜50%），反之则使用随机效应模型。（2）计数资料用相对危险度RR，连续性变量用标准化均数差SMD。（3）采用漏斗图分析纳入文献的偏倚情况。

2 结果

2.1 文献检索结果

数据库检索获得文献（n=746），剔除内容重复文献67 篇（n=679），阅读文章摘要及关键词，剔除非糖尿病肾病、细胞实验、临床试验、理论研究（临床经验、医案、综述）、基础研究、系统评价、Meta 分析（n=639）；精读全文，再排除26 篇：包括学位论文（n=6）；干扰措施包含其他中药提取物（n=13）；观察指标不含主要结局指标（n=7）。最终纳入Meta分析文献（n=14），见图1。

图1 文献筛选流程图Fig 1 Flowchart of literature screening

2.2 文献基本特征

经过严格筛选，最终纳入14 篇文献： Chen等［10］、Jing 等［11］、Liu 等［12］、Tian 等［13］、Wang 等［14］、刘聪 等［15］、李 杭 霖 等［16］、李 萌 等［17］、杨 秀 等［18］、王 军等［19］、赵瀚微等［20］、赵良瑞等［21］、陶松青等［22］、齐宝宁等［23］，合计304 只大鼠，其中模型组152 只，干预组152 只。具体特征详见表1。

表1 纳入文献的基本信息Tab 1 Basic information of included literature

2.3 方法学质量评价

应用上文中提到的评估工具开展质量评价：序列产生方面：14 篇研究中均有提出，有3 篇指明具体的分配序列的方法，判定其偏倚风险较低，另有3 篇的随机方法存在高风险，其余研究中只提及随机，偏倚风险尚不清楚。动物安置随机化方面：有11 篇文献具体描述了各组动物的安置条件，偏倚风险较低。结果评估随机性：有2 篇文献从造模成功的大鼠中随机抽取，认为其中偏倚风险较低，其余则均未提及。在结果评价盲法方面、基线特征、分配隐藏、等其他方面：具体评价结果见图2。

图2 纳入文献偏倚风险评估Fig 2 Risk assessment of bias of included literature

2.4 模型组与大黄素组的Meta 分析

2.4.1 血糖 有 9 篇研究报道了血糖的变化。因分析显示异质性较大，故选择随机效应模型，结果显示：SMD=-2.51，95%CI（-3.77，-1.24），I2＝89%。大黄素组较模型组血糖低（图3）。为探索可能的异质性来源，按大黄素浓度、给药疗程、动物种属分别进行亚组分析（图4～6）。亚组分析显示不同大黄素浓度分组间交互P检验示（P=0.96，I2=0%）（图4）。不同疗程分组间交互P检验示（P=0.004，I2=88.1%）（图5）。不同动物种属分组间交互P检验示（P=0.55，I2=0%）（图6），亚组分析表示：疗程对血糖异质性的影响较大，而大黄素浓度、动物种属对异质性的影响较小。

图3 大黄素组vs 模型组血糖的Meta 分析Fig 3 Meta-analysis of blood glucose between the emodin group and the model group

图4 按大黄素浓度进行亚组分析：大黄素组vs 模型组血糖的Meta 分析Fig 4 Subgroup analysis by emodin concentration： Meta-analysis of blood glucose in the emodin group vs the model group

图5 按疗程进行亚组分析：大黄素组vs 模型组血糖的Meta 分析Fig 5 Subgroup analysis by treatment course： Meta-analysis of blood glucose in the emodin group vs the model group

图6 按动物种属进行亚组分析：大黄素组vs 模型组血糖的Meta 分析Fig 6 Subgroup analysis by animal species： Meta-analysis of blood glucose in the emodin group vs model group

2.4.2 血肌酐 有7 篇研究报道了实验后血肌酐的变化。结果显示：SMD=-1.62，95%CI（-4.75，-1.34），I2＝91%（图7），大黄素组较模型组血肌酐水平降低。为探索可能的异质性来源，按大黄素浓度、给药疗程、动物种属分别进行亚组分析（图8～10）。亚组分析显示大黄素不同的浓度分组间交互P检验示（P=0.21，I2=36.3%）（图8）。不同疗程分组间交互P检验示（P=0.04，I2=76.5%）（图9）。不同动物种属分组间交互P检验示（P=0.03，I2=77.8%）（图10），亚组分析表示：大黄素弄浓度、疗程、动物种属对异质性的影响较小。

图7 大黄素组vs 模型组血肌酐的Meta 分析Fig 7 Meta-analysis of blood creatinine between the emodin group and the model group

图8 按照大黄素浓度进行亚组分析：大黄素vs 模型组血肌酐的Meta 分析Fig 8 Subgroup analysis by concentration of emodin： Meta-analysis of blood creatinine in the emodin group vs the model group

图9 按照疗程进行亚组分析：大黄素vs 模型组血肌酐的Meta 分析Fig 9 Subgroup analysis by treatment course： Meta-analysis of blood creatinine in the emodin group vs the model group

图10 按照动物种属进行亚组分析：大黄素vs 模型组血肌酐的Meta 分析Fig 10 Subgroup analysis by animal species： Meta-analysis of blood creatinine in the emodin group vs the model group

2.4.3 尿素氮 有7 篇研究报道了实验后尿素氮的变化。结果显示：SMD=-2.69，95%CI（-3.88，-1.50），I2＝82%（图11），大黄素组较模型组低尿素氮水平降低。为探索可能的异质性来源，按大黄素浓度、给药疗程、动物种属分别进行亚组分析（图12～14）。亚组分析显示大黄素不同的浓度分组间交互P检验示（P=0.18，I2=45.5%）（图12）。不同疗程分组间交互P检验示（P=0.000 5，I2=91.6%）（图13）。不同动物种属分组间交互P检验示（P=0.26，I2=22.3%）（图14），亚组分析表示：疗程的不同可能是结果的异质性来源，而大黄素弄浓度、动物种属对异质性的影响较小。

图11 大黄素组vs 模型组尿素氮的Meta 分析Fig 11 Meta-analysis of urea nitrogen between the emodin group and the model group

图12 按照大黄素浓度进行亚组分析：大黄素vs 模型组尿素氮的Meta 分析Fig 12 Subgroup analysis by concentration of emodin： Meta-analysis of urea nitrogen in the emodin group vs the model group

图13 按照疗程进行亚组分析：大黄素vs 模型组尿素氮的Meta 分析Fig 13 Subgroup analysis by treatment course： Meta-analysis of urea nitrogen in the emodin group vs the model group

图14 按照动物种属进行亚组分析：大黄素vs 模型组尿素氮的Meta 分析Fig 14 Subgroup analysis by animal species： Meta-analysis of urea nitrogen in the emodin group vs the model group

2.4.4 UTP 有6 篇研究报道了实验后UTP 的变化。结 果 显 示：SMD=-3.35，95%CI（-4.85，-1.85），I2＝87%（图15），大黄素组较模型组可以降低UTP 水平。为探索可能的异质性来源，按给药浓度、疗程、动物种属分别进行亚组分析（图16～18）。亚组分析显示大黄素不同的浓度分组间交互P检验示（P=0.54，I2=0%）（图16）。不同疗程分组间交互P检验示（P=0.01，I2=84.6%）（图17）。不同动物种属分组间交互P检验示（P=0.22，I2=32.4%）（图18），亚组分析表示：大黄素浓度、疗程、动物种属对异质性的影响较小。

图15 大黄素组vs 模型组UTP 的Meta 分析Fig 15 Meta-analysis of UTP between the emodin group and the model group

图16 按照大黄素浓度进行亚组分析：大黄素vs 模型组UTP 的Meta 分析Fig 16 Subgroup analysis by concentration of emodin： Meta-analysis of UTP in the emodin group vs the model group

图17 按照疗程进行亚组分析：大黄素vs 模型组UTP 的Meta 分析Fig 17 Subgroup analysis by treatment course： Meta-analysis of UTP in the emodin group vs the model group

2.4.5 相对肾重 有3 篇研究报道了动物的相对肾重的变化。结果显示：SMD=-7.72，95%CI（-12.55，-2.88），I2＝90%（图19），结果提示与模型组相比，大黄素组对减轻相对肾重作用更大。

图19 大黄素组vs 模型组相对肾重的Meta 分析Fig 19 Meta-analysis of relative kidney weight between the emodin group and the model group

2.4.6 TC、TG 有2 篇研究报道了实验后甘油三酯 的 变 化。 结 果 显 示：SMD= - 1.19，95%CI（-2.92，-0.55），I2＝77%（图20），大黄素组较模型组可以降低甘油三酯水平。有3 篇研究报道了实验后胆固醇的变化。结果显示：SMD=-1.24，95%CI（-1.94，-0.54），I2＝0%（图21），但其差异无统计学意义。

图20 大黄素组vs 模型组TC 的Meta 分析Fig 20 Meta-analysis of UTP in the emodin group vs the model group

图21 大黄素组vs 模型组TG 的Meta 分析Fig 21 Meta analysis of TG in the emodin group vs the model group

2.5 描述性分析

2.5.1 大黄素可通过上调nephrin 的表达降低蛋白尿，从而减轻足细胞的损伤，有效延缓DN 的进程。

有3 篇研究报道了大黄素保护DN 的肾损伤主要是通过上调 nephrin 的表达，3 篇研究中均显示，与对照组相比，大黄素对STZ 诱导的糖尿病大鼠nephrin 表达下降有显著的改善作用。提示大黄素可通过上调nephrin 的表达降低蛋白尿，减轻足细胞的损伤。

2.5.2 大黄素减轻糖尿病肾病小鼠肾脏的病理改变 有6 篇研究报道了实验后肾脏病理结构的改变，发现与对照组相比，经大黄素治疗的大鼠足细胞足突消失明显减少，从而使足细胞损伤明显减轻。

2.5.3 大黄素作用于不同的信号通路，改善糖尿病肾病大鼠模型肾损害和足细胞损伤。有4 篇研究从不同的通路解释了大黄素治疗糖尿病肾病的可能性。Jing 等［11］提出大黄素在大鼠模型中对糖尿病肾病的肾保护作用是通过PI3K/Akt/GSK3β 和Bax/caspase3 信 号 通 路 介 导 的。Liu 等［12］认 为 大 黄 素 通过调节AMPK/mTOR 介导的自噬信号通路改善糖尿病肾病大鼠模型肾损害和足细胞损伤。齐宝宁等［23］发现大黄素调控miR-21 介导细胞自噬，减轻糖尿病肾病小鼠肾脏氧化性损伤。Tian 等［13］论述了大黄素对糖尿病肾病的保护机制的关键在于大黄素能够抑制相关通路，如PERK 通路，来减轻糖尿病肾病足细胞凋亡。

2.5.4 大黄素可调节多种蛋白的表达，改善糖尿病老鼠肾脏的损伤。 纳入的研究中，有6 篇研究认为大黄素对糖尿病肾脏的保护与某些蛋白密切相关。在Jing 等［11］研究中发现，大黄素对改善糖尿病大鼠的血糖、尿白蛋白排泄量、肾脏重量、肾功能等作用明显。大黄素具有抗炎和抗氧化活性的作用，此研究进一步发现，经大黄素干预后，ICAM-1、Bax等被抑制 ，而相反Akt/GSK-3β 信号通路被激活。在Liu 等［12］研究中认为大黄素显著上调了STZ 诱导的糖尿病大鼠 nephrin 表达下降。提示大黄素可通过上调nephrin 的表达降低蛋白尿，从而有效延缓了DN 的进程。在Tian 等［13］研究中提出大黄素可抑制p38 丝裂原活化蛋白激酶 （MAPK）途径，同时抑制细胞增殖和纤连蛋白（FN）表达，尤其是对于暴露于高葡萄糖的肾小球膜细胞，基于此，研究者们提出了大黄素对肾功能障碍具有保护作用。此外，大黄素还作用于AMPK/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）信号传导，激活自噬，从而保护大鼠肾小管细胞免于凋亡。在Wang 等［14］研究中提示大黄素抑制 p38 MAPK 信号通路激活及下调纤连蛋白表达可能是其保护作用的机制之一。杨秀等［18］研究中从mRNA 和蛋白表达两个层面证实，大黄素能抑制MMP-2/TIMP-2 的表达，并减少了尿白蛋白的排泄，但还有待于对其机制进一步阐明。

2.6 敏感性分析

为提高研究的稳定性，选择根据给药浓度、给药疗程、动物品种的不同把所纳入研究的数据进行敏感性分析，进一步评价大黄素的效果。逐一剔除各个研究，观察其结果并未发生显著变化，敏感性分析的结论提示：结果较稳定。

2.7 漏斗图

通过漏斗图分析大黄素对糖尿病肾病的保护机制的发表偏倚，选择血糖指标做漏斗图。图形显示：散点分布不对称，存在一定的发表偏倚，见图22。

图22 血糖的发表偏倚结果Fig 22 Publication bias results of blood glucose

3 讨论

本研究主要从血糖、SCR、BUN、24 h 尿蛋白量、相对肾重量、TC、TG 等方面评价。结果表明，在调控大鼠的血糖、BUN、Scr 和24 h 尿蛋白方面，大黄素能发挥更佳作用。在亚组分析中，给药疗程对血糖、BUN 的异质性影响较大，这提示疗程的不同可能是结果的异质性来源。而血肌酐、24 h 尿蛋白、相对肾重的异质性与大黄素浓度、疗程、动物种属关系不大，这提示可能与老鼠体重、造模方式等造成的异质性有关。

在中国，大黄的使用越来越广泛，而大黄素作为其重要的单体，结构稳定，功用较多，且机制明确［24］。随着实验技术的发展，大黄素治疗糖尿病肾病中的机理逐步被揭开了面纱，在调节糖脂代谢，保护肾脏保护中等方面都发挥了及其重要的作用。

大黄素保护肾脏的作用机制可能与以下因素有关：（1）大黄素通过上调nephrin 表达来改善葡萄糖诱导的EMT 及随后的足细胞功能障碍，足细胞受到保护，因而DN 的进程得到控制。（2）大黄素可促进DN 小鼠肾脏细胞自噬，减轻其肾脏氧化性损伤。大黄素上调了DN 小鼠肾脏P62、Atg7 和 LC3 三种蛋白表达，降低凋亡蛋白Caspase-3 和bax 的表达，并增强凋亡蛋白bcl-2 的水平，肾脏病理性损伤明显减轻，肾脏ROS 含量显著降低，而肾脏足细胞自噬程度显著增强。（3）大黄素可显著下调磷酸化p38 MAPK 和磷酸化CREB 蛋白的表达，减少纤连蛋白的产生，抑制肾脏肥大、减轻肾小球高滤过、减少蛋白尿、调节脂质代谢紊乱、抑制细胞外基质增加，从而也能延缓肾病的发展。

尽管大黄素的作用机制日益明朗，但尚缺乏实验及临床的大量数据，通过动物实验研究则可获得可靠的数据资料，亦是探索疾病过程，而基于动物实验的Meta 分析又将不同的地点，不同学者的研究进一步汇总，统计分析，又可验证实验结论，能得到可靠且准确的结论，为临床药物的运用、疗效的分析提供多中心，大样本的数据支持。

本次Meta 分析的局限性：（1）纳入研究的样本量普遍较小，导致多项指标存在异质性。（2）大黄素自身特性如纯度、聚合度也没有详细报道，可能使结果存在一定的偏差。（3） 本次纳入的所有研究，其动物模型较单一，排除了其他动物模型如蛙、兔等。综上所述，大黄素能有效降低患病大鼠的空腹血糖，对大鼠的BUN、Scr、24 h 尿蛋白值也有改善，对糖尿病大鼠早期肾损伤具有一定的保护作用，但仍需要更高质量、更大样本的研究进一步评价大黄素对肾损伤的保护作用。

作者贡献度说明：

何望：搜索及筛选相关文献，数据汇总，统计分析，完成论文的主要撰写；黄国顺：负责文献的筛选，数据的初步处理；张凯钰：进行文献收集，数据的最后汇总，图表设计；周恩超：提供论文写作思路，负责初步审稿、修稿及定稿。

所有作者声明不存在利益冲突关系。