青花菜转录因子基因BoiWRKY8及其与抗病性的关系

蒋 明 何佳薇 方宇洁 尹龙飞 张慧娟

（台州学院生命科学学院，浙江 椒江 318000）

青花菜（Brassicaoleraceavar.italica）又名西兰花、木立花椰菜和绿菜花等，为十字花科（Cruciferae）芸薹属一、二年生蔬菜，以花球和花茎为主要食用部位，富含维生素A、维生素C、维生素K、萝卜硫苷（sulforaphane glucosinolate）、抗氧化物质和膳食纤维等，是一种深受消费者喜爱的保健蔬菜［1-4］。青花菜原产地中海中部地区，目前很多国家都有栽培，我国已成为世界最大的青花菜种植国和出口国之一，年栽培面积超过8.6 万公顷，年产量约400 万吨，年出口量约13 万吨［5-6］。菌核病和灰霉病是青花菜的两种重要病害，分别由核盘菌（Sclerotiniasclerotiorum）和灰霉菌（Botrytiscinerea）引起，它们危害叶片、茎和花球，导致青花菜产量和品质下降，每年造成的经济损失十分巨大［7-8］。青花菜引入我国的时间较短，虽然引进或育成的品种数量众多，但主栽品种之间的亲缘关系较近，遗传多样性程度较低，优质种质资源十分匮乏［6］；青花菜抗病材料更为稀缺，通过挖掘抗病相关基因开展分子育种，是解决这一问题的重要手段。

转录因子在调控基因表达方面起着重要作用，其不仅参与细胞分化、生长、发育等生物学过程，还参与生物胁迫和非生物胁迫响应［9-12］。AP2/EREBP、MYB、WRKY、NAC、bHLH 和bZIP 等是植物的重要转录因子，能够参与多种胁迫反应，明确上述转录因子的生物学功能，可为后续的抗逆分子育种提供优良的靶标基因［13-14］。WRKY 转录因子广泛参与干旱、盐碱、重金属、虫害等逆境响应，近年来有不少研究和报道［15-16］。WRKY 在抗病反应中的研究也有相关报道，拟南芥（Arabidopsisthaliana）AtWRKY33的过量表达，可显著增强植株对灰霉菌和甘蓝链格孢菌（Alternariabrassicicola）的抗性［17］。将来自葡萄（Vitisvinifera）的VvWRKY1基因转入烟草（Nicotianatabacum），转基因植株对烟草霜霉菌（Peronosporatabacina）和二孢白粉菌（Erysiphe cichoracearum）的抗性增加［18］。小麦（Triticumaestivum）TaWRKY62的表达受条锈菌（Pucciniastriiformisf.sp.tritici）的诱导，该基因的过量表达增强了对条锈病的抗病能力［19］。目前，有关WRKY 在青花菜抗病反应中的研究较少，因此本研究在克隆BoiWRKY8基因的基础上，开展序列分析和表达分析，以期初步明确该基因在菌核病和灰霉病抗病反应中的功能，为后续开展抗病机理研究和分子育种奠定基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

青花菜纯合材料Bo0113 由台州学院分子生物学创新实验室构建，栽植于人工气候箱，培养条件为16 h光照/8 h黑暗。核盘菌菌株HP-22和灰霉菌菌株HM-18 均采自临海青花菜基地，经分离、纯化、鉴定后备用。大肠杆菌（Escherichiacoli）DH5α 菌株和根癌农杆菌（Agrobacteriumtumefaciens）菌株LBA4404 均由实验室保藏。病原菌的接种在三叶一心期进行，分别于0、12、24、48 和72 h 时收集叶片，用液氮速冻后置于-80 ℃的超低温冰箱中保存。

1.2 试验方法

1.2.1 DNA与RNA的提取、cDNA 的合成 叶片用液氮冷冻，再用研棒磨成粉末，DNA 的提取采用十六烷基三甲基溴化铵（cetyltriethylammnonium bromide，CTAB）法。分别以对照及病原菌处理的叶片为材料，经液氮冷冻后研成粉末，RNA 提取采用TRIzol 法，操作在超净工作台上进行；cDNA 的合成采用cDNA 合成试剂盒（TaKaRa，日本），根据其提供的说明书进行。

1.2.2 基因的克隆 根据NCBI 数据库（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/）野甘蓝（B.oleraceavar.oleracea）（登录号：XP_013596685.1）WRKY8基因序列设计引物，上游/下游引物分别引入SmaI 和BamH I 酶切位点，引物序列分别为5′-CATCCCGGGATGTCTAATG AAACCAAAGATCTT-3′和5′-TACGGATCCTCAAGGT TCTTGCTTGAGGA-3′。以叶片DNA 和cDNA 为模板进行聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）扩增，反应体系共20 μL：2 μL 10×缓冲液，20 μmol·L-1引物各0.35 μL，基因组DNA 或cDNA 30 ng，10 mmol·L-1dNTPs 0.4 μL，2 U·μL-1TaqDNA 聚合酶1.2 U，加ddH2O 至终体积。反应程序为：94 ℃ 预变性5 min；94 ℃变性30 s，56 ℃ 退火45 s，72 ℃ 延伸2.5 min，33个循环；72 ℃终延伸10 min。PCR 产物经回收、纯化，与T-easy 载体（Promega，美国）连接，反应参考说明书进行。阳性克隆经PCR 检测后测序，PCR 反应体系、程序与基因克隆相同，模板改为菌液。

1.2.3 序列分析 BoiWRKY8 的同源序列下载自NCBI，分别为野甘蓝、芜菁（B.rapa）（XP_009101520.1）、甘蓝型油菜（B.napus）（XP_013698158.1）、萝卜（Raphanussativus）（XP_018456683.1）、盐芥（Eutrema salsugineum）（ESQ39783.1）、拟南芥（Arabidopsisthaliana）（OAO90538.1）、琴叶拟南芥（A.lyratasubsp.lyrata）（EFH39665.1）、亚麻荠（Camelinasativa）（XP_010441593.1）、荠菜（Capsellarubella）（EOA13673.1）和高山南芥（Arabisalpina）（KFK31474.1）。利用在线工具ProtParam（http：//web.expasy.org/protparam/）预测分子量和等电点；SMART在线工具（http：//smart.emblheidelberg.de）用于预测编码蛋白的结构域；Clustal X 1.81 软件用于BoiWRKY8 及同源蛋白序列的多重比对；采用Mega 3.1 构建系统发育树，建树方法为邻接法（Neighbor-Joining），自举检测值为1 000。

1.2.4 表达分析 实时荧光定量PCR（quantitative real-time PCR，qRT-PCR）在LightCycler®96 荧光定量PCR 仪（Roche，瑞士）上进行，引物序列根据测序结果设计，上下游引物分别为5′-CATCGTATGATCATTACA ACAGCATCAAC-3′和5′-GACACGAGTGTAGATCAGAA CCG-3′；内标为肌动蛋白基因，引物分别为5′-ACGTG GACATCAGGAAGGAC-3′和5′-GAACCACCGATCCAG ACACT-3′。反应体系为20 μL：Master Mix 10 μL，20 μmol·L-1上下游引物各0.2 μL，cDNA 4 μL，ddH2O 5.6 μL。反应程序为：95 ℃ 预变性10 min；95 ℃ 变性15 s，55 ℃ 退火15 s，72 ℃ 延伸30 s，40 个循环。所有试验重复3 次，相对表达量的计算采用2-△△Ct方法［20］。

1.2.5 遗传转化 PCR 产物、pBI121 载体用SmaI 和BamH I 双酶切，经纯化后用T4连接酶连接，经测序验证后获得重组载体pBI121-BoiWRKY8。利用热激法将pBI121-BoiWRKY8转入根癌农杆菌（Agrobacterium tumefaciens），菌株为LBA4404，遗传转化植株的创制采用Jiang等［21］的方法。筛选至T3代，其中的WK02-07-24和WK22-21-04用于后续试验。转基因植株的验证采用PCR法，以重组质粒、对照植株、2个株系的DNA为模板，引物分别为5′-CTCCTCGGATTCCATTGCCCAG-3′和5′-TACGGCGACTGGTCGGGATC-3′，程序和体系同1.2.2。标志基因的表达采用qRT-PCR 法，PR1引物为5′-AAAGCTACGCCGACCGACTACGAG-3′和5′-CC AGAAAAGTCGGCGCTACTCCA-3′，而PDF1.2引物为5′-TCCATCATCACCCTTCTCTTCGC-3′和5′-CCATGTT GTGCTCCTTCAAGTCG-3′，程序与反应体系同1.2.4。

1.2.6 抗病性鉴定及统计分析 核盘菌和灰霉菌接种于马铃薯葡萄糖琼脂（potato dextrose agar，PDA）培养基，培养温度为（22±2） ℃。待菌丝长至培养基边缘时，用打孔器切割菌饼，把长有菌丝的一侧贴于叶片背面，培养3 d 时测量病斑直径，试验重复3 次。数据处理采用DPS 9.01 软件，多重比对利用邓肯氏新复极差测验法。

2 结果与分析

2.1 BoiWRKY8的序列特征

分别以基因组DNA 和cDNA 为模板，扩增到各自的全长序列。测序结果表明，BoiWRKY8的基因组全长为3 170 bp，具2个内含子，长度分别为776和1 422 bp，内含子遵循GU-AG 规则，3 个外显子的长度分别为455、144 和373 bp（图1）。BoiWRKY8的编码区全长为972 bp，编码323个氨基酸，蛋白质的分子量为36 kDa，等电点为6.70。蛋白质二级结构预测结果表明，在+179 和+238 之间含1 个长度为60 个氨基酸的WRKY结构域，该结构域具1 个WRKYGQK 和1 个C2H2锌指结构，C2H2可用通式C-X4-C-X23-H-X1-H 表示，其中的X指任何氨基酸（图2）。

图1 BoiWRKY8的基因结构Fig.1 Gene structure of BoiWRKY8

图2 BoiWRKY8的编码区及推导的氨基酸序列Fig.2 Complete coding sequence of BoiWRKY8 and its deduced amino acids

2.2 序列比对和系统发育分析

利用Clustal X 1.81 对BoiWRKY8 及10 条十字花科同源蛋白序列进行多重比对，结果表明，BoiWRKY8与野甘蓝的同源序列最为相似，仅有2 个氨基酸残基的差异，分别位于+279 和+283 位；与高山南芥的相似性最低，为81%。11 条蛋白序列的WRKY 结构域十分保守，除高山南芥外，其余10 个结构域的序列完全一致，高山南芥与其他WRKY 结构域之间存在1 个氨基酸残基的差异（图3）。

图3 BoiWRKY8及同源序列的多重比对Fig.3 Multiple alignments of BoiWRKY8 and its homologous sequences

利用邻接法构建系统发育树，结果如图4 所示。11条WRKY序列在系统发育树上可分为5组，用Ⅰ～Ⅴ表示。4种芸薹属植物聚于组I，支持率为100%，该组分为2个亚组，BoiWRKY8与野甘蓝聚于一个亚组，芜菁与甘蓝型油菜聚于另一个亚组，支持率分别为94%和99%。萝卜、盐芥和高山南芥各自单独成组，即组Ⅱ、Ⅲ和Ⅴ，亚麻荠、荠菜、拟南芥和琴叶南芥聚于组Ⅳ，支持率达99%（图4）。

图4 基于邻接法构建的BoiWRKY8及同源序列的系统发育树Fig.4 The phylogenetic tree of BoiWRKY8 and its homologous sequences using Neighbor-Joining method

2.3 BoiWRKY8的表达

利用qRT-PCR检测BoiWRKY8在核盘菌和灰霉菌侵染下的表达，结果表明，该基因的表达受这两种病原真菌的诱导，表达量随侵染时间呈先上升后下降的趋势（图5）。在核盘菌诱导下，BoiWRKY8的表达量在6和12 h 时达到最大值，分别为对照的3.18 和3.22 倍，之后逐渐下降，48 和72 h 时仍显著高于对照，表达量分别为对照的1.49 和1.35 倍。在灰霉菌诱导下的表达量变化与核盘菌相似，BoiWRKY8的表达量在6 和12 h 达到最大值，分别为对照的2.68 和2.90 倍，之后逐渐下降，48 h 时的表达量为对照的1.46 倍，差异达显著标准，但72 h时的表达量与对照没有显著差异。

图5 BoiWRKY8在核盘菌和灰霉菌侵染下的表达Fig.5 Expression of BoiWRKY8 in response to Sclerotinia sclerotiorum and Botrytis cinerea

2.4 遗传转化结果

以T3 株系WK02-07-24 和WK22-21-04 为试验材料，利用PCR进行检测，结果均为阳性植株（图6-A）。利用qRT-PCR检测BoiWRKY8的表达量，结果显示，在35S启动子的驱动下，该基因的表达量在两个过表达转基因株系中显著提高，分别为对照的8.77和13.84倍（图6-B）。

图6 PCR检测及BoiWRKY8在过量表达株系中的表达Fig.6 PCR detection and expression analysis of BoiWRKY8 over-expressing lines

2.5 抗病性鉴定

对照植株、过量表达株系WK02-07-24 和WK22-21-04 接种病原菌后，均出现病斑，但大小存在一定的差异（图7-A、B）。在核盘菌侵染下，对照病斑的平均直径为2.03 cm，而两个过量表达株系的病斑大小分别为1.50和1.10 cm，均显著小于对照（图7-C）；在灰霉菌侵染下，对照植株的病斑直径为2.20 cm，而两个过量表达株系的病斑大小分别为1.60和1.37 cm，均显著小于对照（图7-D）。抗病性鉴定结果表明，BoiWRKY8的过量表达可显著增加青花菜对核盘菌和灰霉菌的抗性。

图7 BoiWRKY8过量表达对抗病性的影响Fig.7 BoiWRKY8 overexpression on resistance to diseases

利用qRT-PCR 检测水杨酸（salicylic acid，SA）途径标志基因PR1和茉莉酸/乙烯（jasmonic acid/ethylene，JA/ET）途径标志基因PDF1.2的表达，结果表明，PR1基因表达量在对照和两个过量表达株系间没有显著差异，但PDF1.2的表达量在3 个株系间存在显著差异（图8）。在核盘菌侵染下，PDF1.2在WK02-07-24 和WK22-21-04 的表达量显著提高，分别为对照的2.30和3.59 倍；在灰霉菌诱导下，WK02-07-24 和WK22-21-04 的表达量分别为对照的2.11 与2.96 倍，均达到显著水平。

图8 病程相关蛋白基因的表达Fig.8 Expression of pathogenesis-related protein genes

3 讨论

WRKY 转录因子参与植物生长和发育，涉及种子萌发、形态发生、根系生长、开花时间等的调控，此外，该类转录因子在生物胁迫和非生物胁迫方面有诸多报道［16-17，22］。WRKY 因蛋白质的N 端含保守的WRKYGQK序列而得名，以家族形式存在，在拟南芥和水稻中分别有72 和100 个成员［23］。根据WRKY 结构域的数量及N 端锌指结构的类型，WRKY 可分为三大类，第一类含2 个WRKY 结构域，锌指结构类型为C2H2，第二类和第三类均只含1 个WRKY 结构域，锌指结构分别为C2H2和C2HC［23-24］。本研究以青花菜为材料，克隆到BoiWRKY8基因，推导的氨基酸序列含1 个WRKY 结构域，其N 端的锌指结构为C2H2，因此BoiWRKY8 属于第二类。WRKY 结构域通常十分保守，该结构域可特异识别启动子区域的TTGACC/T 序列并与之结合，从而精确调控基因的表达［25］。本研究中，BoiWRKY8 与9 条同源序列的WRKY 结构域完全一致，而与高山南芥仅存在一个氨基酸残基的差异，结构域的保守性与功能稳定性密切相关，以确保WRKY结构域与特定的DNA 序列结合，从而实现特定的调控功能。WRKY 转录因子参与多种胁迫，在拟南芥中，49 个WRKY成员受丁香假单胞杆菌（Pseudomonas syringae）或水杨酸的诱导［26］。雷蒙德氏棉（Gossypium raimondii）的12 个WRKY基因受盐胁迫的诱导，同时，这些基因的表达量在大丽轮枝菌（Verticilliumdahliae）的侵染下显著提高［27］。陆地棉（G.hirsutum）GhWRKY15的表达受棉刺盘孢菌（Colletotrichumgossypii）、棉花枯萎病菌（Fusariumoxysporumf.sp.vasinfectum）和立枯丝核菌（Rhizoctoniasolani）的诱导［28］。本研究中，BoiWRKY8的表达受核盘菌和灰霉菌的诱导，表达量呈现先上升后下降的趋势，且两种病原菌诱导下的表达模式相似，推测该基因在抗病反应中起着一定的作用。

WRKY转录因子基因在植物抗病反应中起着重要作用，利用病毒诱导的基因沉默（virus-induced gene silencing，VIGS）抑制芍药（Paeonialactiflora）PlWRKY65基因的表达，结果表明，叶片对极细链格孢（Alternaria tenuissima）的感病性增加［29］。陆地棉GhWRKY15的过量表达，显著增强了烟草对烟草花叶病毒（tobacco mosaic virus，TMV）、黄瓜花叶病毒（cucumber mosaic virus，CMV）、棉刺盘孢菌和寄生疫霉（Phytophthora parasitica）的抵抗能力［28］。水稻OsWRKY4和OsWRKY80受立枯丝核菌的快速诱导，在水稻中过量表达，能显著增强其对该病原真菌的抗性［30］。本研究中，BoiWRKY8在青花菜中的过量表达，可显著提高核盘菌和灰霉菌的抵御能力。在抗病反应中，激素物质JA、SA和ET起着十分重要的作用，SA 信号途径通常与活体寄生的病原菌抗性相关，而JA、ET 途径则参与死体寄生病原菌的响应［31-33］。PR1和PDF1.2分别为SA 途径与JA/ET信号途径的关键基因，可作为两个抗病途径的标志基因［30］。GhWRKY15在烟草中过量表达，显著增强了标志基因PR1的表达［28］；拟南芥WRKY33的突变导致植株对灰霉菌和甘蓝链格孢菌这两种死体营养型真菌的抗性减弱，同时标志基因PDF1.2的表达量显著降低［17］。将小麦（Triticumaestivum）TaWRKY142基因导入拟南芥，其对希金斯炭疽菌（C.higginsianum）的抗性增加，同时，标志基因AtPDF1.2的表达量显著提高［34］。核盘菌和灰霉菌均为死体营养型，本研究中，BoiWRKY8的过量表达对两种病原真菌的抗性显著增强，PR1的表达量与对照没有显著差异，而PDF1.2的表达量显著提高。JA/ET 标志基因PDF1.2编码一种抗菌肽，被广泛认为是植物对抗病原菌的重要防御因子之一，BoiWRKY8的过量表达引起BoiPDF1.2表达量的显著提高，使植物产生更多的抗菌肽，从而有效抑制核盘菌和灰霉菌的生长和侵染。

4 结论

本研究以青花菜为材料，在克隆BoiWRKY8基因的基础上，明确了基因的序列特点和表达特征，并初步明确了该基因在抗病反应中的功能。BoiWRKY8的编码区全长为972 bp，编码323 个氨基酸，WRKY 结构域具一个WRKYGQK 序列和一个C2H2锌指结构，与来自芸薹属植物的同源序列聚为一组。BoiWRKY8的表达受核盘菌和灰霉菌的诱导，该基因的过量表达植株对核盘菌、灰霉菌的抗性显著增强，JA/ET 通路标志基因BoPDF1.2的表达量显著提高。