基于网络药理学及实验探究益癸方汤防治绝经后骨质疏松症的作用及机制

单珊 王佳晨 陈怡洁 徐哲昀 李伊伊 盛祝梅 黄飞翔 孟丽丽 张治芬

骨质疏松症（osteoporosis，OP）是以骨量减少和骨微细结构紊乱为特征的系统代谢性疾病[1]，其对老年妇女和绝经后妇女的影响尤为严重，大约一半的女性在绝经后至少经历过一次骨质疏松性骨折[2]。更年期女性随着卵巢功能的下降，雌激素产生减少，同时卵泡刺激素（follicle-stimulating hormone，FSH）水平增加，导致绝经后骨质疏松症（postmenopausal osteoporosis，PMOP）的发生、发展[3]。目前PMOP 治疗仍以口服药物为主，但长期药物治疗可能会导致耐药和不良反应。而中草药疗法因不良反应小易被患者接受。益癸方汤是临床经验方，本课题组前期研究结果表明益癸方汤可改善更年期女性围绝经期症状，降低FSH 和LDL 水平，提高雌二醇（estradiol，E2）水平[4]。但该方对于骨量保护是否有作用尚缺乏相关研究，本研究通过网络药理学分析和实验探究该方防治PMOP 的作用及机制，现将结果报道如下。

1 材料和方法

1.1 实验动物 8 周龄SPF 级雌性SD 大鼠25 只，体质量200～250 g，购自浙江中医药大学动物实验中心，动物许可证号：SYXK（浙）2021-0012。大鼠饲养于浙江中医药大学动物实验中心，室温22～26 ℃，相对湿度50%～60%，自由进食水，12 h 间隔照明。本研究经浙江中医药大学实验动物管理与伦理委员会审查通过（批准文号：IACUC-20221121-15）。

1.2 药品、试剂和仪器 益癸方汤组方为枸杞、旱莲草各10 g，红景天6 g，阿胶9 g，黄精、当归各10 g，茯苓15 g，黑大豆10 g，丹参、首乌藤各15 g，郁金10 g，由杭州市妇产科医院中药房煎煮，浓缩成100 mL/袋，4 ℃冰箱保存。戊酸雌二醇片（批号：727A，规格：1 mg/片，拜耳医药保健有限公司广州分公司）；戊巴比妥钠（批号：57-33-0，杭州馨然公司）；HE 染色试剂（批号：G1120、G1821，北京索莱宝公司）；EDTA 脱钙液（批号：BL616B，安徽合肥白鲨公司；4%多聚甲醛（批号：BL539A，安徽合肥白鲨公司）；Ⅰ型前胶原N 端前肽（procollagen type ⅠN-terminal propeptide，PINP）、抗酒石酸酸性磷酸酶5b（tartrate resistant acid phosphatase 5b，TR-ACP-5b）、E2、FSH ELISA 试剂盒（批 号：RX302968R、RX300578R、RXJ302812R、RXJ302805R，武汉睿信生物公司）；BCA 蛋白浓度测定试剂盒（批号：P0012S，上海碧云天公司）；RIPA 裂解液（批号：P0013B，上海碧云天公司）；分子量标志物Marker（批号：GF6616，上海积福公司）；信号传导和转录激活因子3（signal transducer and activator of transcription 3，STAT3）、Janus 激酶（janus kinase，JAK）、蛋白激酶B（protein kinase B，Akt）抗体（批号：YT4443、YT2424、YT0185，苏州Immunoway 公司）；正置显微镜（型号：MoticAE 2000，厦门麦克奥迪）；全自动脱水机（型号：Excelsior AS，美国赛默飞公司）；切片机（型号：Leica RM2255，德国莱卡公司）、包埋机（型号：Arcadia H，德国莱卡公司）、染色机（型号：Gemini AS，美国赛默公司）、自动封片机（型号：ClearVue，美国赛默飞公司）；微型计算机断层扫描（micro-computed tomography，Micro-CT）仪（型号：skyscan1276，美国bruker 公司）；电泳仪（型号：1658001，北京伯乐公司）；蛋白扫膜仪（型号：FluorChem Q，美国Proteinsimple 公司）。

1.3 方法

1.3.1 药物活性成分的获取 通过中药系统药理学数据库与分析平台搜索益癸方所含药物，设置口服生物利用度≥30%和类药性≥0.18，搜索单味中药相关的药物活性成分。对于上述数据库未收录药物，通过本草组鉴数据库（http://herb.ac.cn/）及相关文献进行补充。

1.3.2 活性成分作用靶点的预测及疾病靶点基因的筛选 在Swiss Target Prediction 数据库中利用Molecule smile 预测药物活性成分潜在作用靶点，设置筛选条件为Probability＞0.1。通过GeneCard 数据库（https://www.Genecards.org/）、OMIM 数据库（https://www.omim.org/）、Drugbank 数据库（https://go.drugbank.com/）、PGKB数据库（https://www.pharmgkb.org/）、GenClip 数据库（http://ci.smu.edu.cn/genclip3/analysis.php）、TTD 数据库（https://db.id-rblab.net/ttd/）搜索“绝经后骨质疏松症（postmenopausal osteoporosis）”和“更年期骨质疏松症（menopausal osteoporosis）”相关基因，其中GeneCard 数据库取score≥1 的靶点。去重并集后导出相关基因。

1.3.3 益癸方汤-PMOP 及更年期骨质疏松症靶点网格构建和核心靶点筛选 将中药有效成分潜在作用靶点与疾病相关靶点导入Cytoscape 3.7.1 中进行药物-疾病靶点网格的构建,获得蛋白质-蛋白质相互作用关系（protein-protein interactions，PPI），并对该网格进行分析，节点大小与其重要性呈正相关。将中药成分潜在作用靶点信息与疾病相关共有靶点导入Cytoscape 3.7.1 中分析，取度中位数、接近性中心性中位数、两者之间中心性位数，筛选出15 个核心靶点。

1.3.4 对潜在靶点进行基因本体论（gene ontology，GO）及京都基因与基因组百科全书（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）可视化分析 将药物作用于疾病的潜在靶点导入Metascape 平台（https://metascape.org/gp/-index.html#/main/step1），进行可视化处理。GO 分析包括生物过程、分子组件、分子功能，采用KEGG 分析信号通路。

1.3.5 动物模型制备、分组及给药 大鼠适应性喂养1 周，采用随机数字表法分为假手术组、模型组、益癸方汤组、戊酸雌二醇组、益癸方汤+戊酸雌二醇组，每组5 只。除假手术组以外，其余组采用去卵巢手术法造模[5]，假手术组开腹后切除腹腔内黄豆大小一块脂肪。术后所有大鼠肌肉注射青霉素3 d，以防感染。观察各组大鼠精神状态及饮食情况，术后1 个月开始给药，根据人与大鼠用药换算系数，计算出实验药物剂量。益癸方汤组给予10 mL/（kg·d）益癸方汤灌胃，戊酸雌二醇组给予0.21 mg/（kg·d）戊酸雌二醇灌胃，益癸方汤+戊酸雌二醇组给予益癸方汤10 mL/（kg·d）+戊酸雌二醇0.21 mg/（kg·d）灌胃，模型组及假手术组给予10 mL/（kg·d）蒸馏水灌胃，共给药12 周。最后1次灌胃后，按照0.2 mL/100 g 的剂量注射2%戊巴比妥钠麻醉后取主动脉血，3 000 r/min，离心15 min，获得血清保存于-80 ℃冰箱。以颈椎脱臼法处死大鼠，取大鼠左右后肢股骨，左侧股骨置于4%多聚甲醛中常温固定；右侧股骨置于高温消毒后EP 管中，-80 ℃冰箱保存。

1.3.6 股骨组织骨微细结构检测 采用Micro-CT 扫描。将完整左侧股骨组织在4%多聚甲醛中固定24～48 h 后取出，进行Micro-CT 扫描，获取股骨平面图像，配套CTAn、CT vox 软件进行骨微细结构分析，软件分析时在Micro-CT 扫描成像图上选择股骨远端作为感兴趣区域，包括骨体积分数（bone volume/tissue volume，BV/TV）、骨小梁厚度（trabecular thickness，Tb.Th）、骨小梁数量（trabecular number，Tb.N）、骨小梁间隔（trabecular separation，Tb.Sp）。

1.3.7 骨组织病理变化情况观察 采用HE 染色。左侧股骨组织Micro-CT 扫描完毕后，置于EDTA 脱钙液中，每周更换1 次液体，2 个月后脱钙完全后用流动双蒸水冲洗2 h 以上，依次进行脱水、石蜡包埋、切片、HE染色及封片，正置显微镜下观察骨组织病理变化。

1.3.8 血清PINP、TRACP-5b、E2、FSH 水平检测 采用ELISA 法。严格按照ELISA 试剂盒说明书检测血清PINP、TRACP-5b、E2、FSH 水平。

1.3.9 股骨组织中STAT3、JAK、Akt 蛋白表达水平检测 采用Western blot 法。将右侧股骨组织剪成绿豆大小，液氮下研磨，加入适量裂解液，冰上裂解30 min，再放入组织研磨器中研磨，4 ℃12 000 r/min，离心15 min，收集上清液。BCA 法测定蛋白浓度，计算20 μg 的总蛋白进行上样，电泳仪将凝胶膜上蛋白转移至纤维膜上，配制5%脱脂牛奶封闭1 h，洗膜3 次，将对应目的蛋白和内参条带放于STAT3、JAK、Akt、甘油醛-3-磷酸脱氢酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）一抗中4 ℃摇床上孵育过夜，次日吸掉一抗，洗膜3 次，加入二抗，室温摇床上孵育1 h，洗膜3 次，加入显影剂进行显影摄片。使用Image J 软件对显影图像进行灰度值分析。

1.4 统计学处理 采用SPSS 25.0 统计软件。计量资料组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSDt检验。P＜0.05 为差异有统计意义。

2 结果

2.1 益癸方汤防治PMOP 及更年期骨质疏松症的网络药理学分析结果

2.1.1 益癸方汤活性成分及相应靶点获取 益癸方汤中含有157 种有效活性成分，319 个靶点，主要活性成分有槲皮素、木犀草素、丹参酮、柚皮素、谷甾醇等，见图1（插页）。

图1 益癸方汤活性成分和PMOP 靶点

2.1.2 益癸方汤靶点基因的预测及PMOP、更年期骨质疏松症靶点基因的筛选 利用数据库筛选出更年期骨质疏松症相关靶点1 405 个，PMOP 相关靶点1 199 个，两者并集靶点去重后为1 775 个。

2.1.3 益癸方汤有效成分和PMOP 靶点PPI 网络构建 使用Cytoscape 3.7.1 构建获得活性成分与疾病共有靶点145 个，核心靶点包括丝裂原活化蛋白激酶3（mitogen-activated protein kinase 3，MAPK3）、Akt1、IL-1β、TNF、TP53 等，见图2。

图2 15 个核心靶点

2.1.4 GO 和KEGG 分析结果 GO 与KEGG 分析结果显示，生物过程涉及炎症反应的调节、对激素的反应、对肽类的反应、细胞对有机氮化合物反应等，分子组件涉及受体、质膜、囊腔等，分子功能涉及氧化还原酶活性、核受体活性、配体活化转录因子活性等，可能作用途径有癌症途径、高级糖基化终末产物-受体信号通路、磷脂酰肌醇3 激酶（phosphatidylinositol 3，PI3K）/Akt 信号通路、MAPK 信号通路等。

2.2 实验结果

2.2.1 各组大鼠股骨组织BV/TV、Tb.Th、Tb.N、Tb.Sp比较 各组大鼠股骨组织BV/TV、Tb.Th、Tb.N、Tb.Sp比较，差异均有统计学意义（F=79.568、9.070、10.368、11.256，均P＜0.001）。与假手术组比较，模型组、益癸方汤组、戊酸雌二醇组、益癸方汤+戊酸雌二醇组大鼠股骨组织BV/TV、Tb.Th、Tb.N 均下降，Tb.Sp 均增加，差异均有统计学意义（均P＜0.01）。与模型组比较，益癸方汤组、戊酸雌二醇组、益癸方汤+戊酸雌二醇组大鼠股骨组织BV/TV、Tb.Th 均增加；戊酸雌二醇组、益癸方汤+戊酸雌二醇组大鼠股骨组织Tb.N 均增加，Tb.Sp 均下降，差异均有统计学意义（均P＜0.05），见图3。从Micro-CT 二维图和三维图可见，与模型组比较，益癸方汤组、戊酸雌二醇组、益癸方汤+戊酸雌二醇组大鼠股骨组织Tb.N 增多、致密，见图4。

图3 各组大鼠股骨组织BV/TV、Tb.Th、Tb.N、Tb.Sp 比较（A：BV/TV 比较；B：Tb.Th 比较；C：Tb.N 比较；D：Tb.Sp 比较）

图4 各组大鼠股骨Micro-CT 二维图、三维图

2.2.2 各组大鼠股骨组织病理变化情况比较 与假手术组比较，模型组、益癸方汤组、戊酸雌二醇组、益癸方汤+戊酸雌二醇组大鼠股骨组织中骨小梁减少、变细；与模型组比较，益癸方汤组、戊酸雌二醇组、益癸方汤+戊酸雌二醇组大鼠股骨组织中骨小梁增加、变粗，见图5。

图5 各组大鼠股骨组织HE 染色图（A：假手术组；B：模型组；C：益癸方汤组；D：戊酸雌二醇组；E：益癸方汤+戊酸雌二醇组）

2.2.3 各组大鼠血清PINP、TRACP-5b 水平比较 各组大鼠血清PINP、TRACP-5b 水平比较，差异均有统计学意义（F=25.242、9.508，均P＜0.001）。与假手术组比较，模型组、益癸方汤组、戊酸雌二醇组、益癸方汤+戊酸雌二醇组大鼠血清PINP 水平均降低，模型组、益癸方汤组、戊酸雌二醇组大鼠血清TRACP-5b 水平均升高，差异均有统计学意义（均P＜0.05）。与模型组比较，益癸方汤组、戊酸雌二醇组、益癸方汤+戊酸雌二醇组大鼠血清PINP 水平均升高，戊酸雌二醇组、益癸方汤+戊酸雌二醇组大鼠血清TRACP-5b 水平均降低，差异均有统计学意义（均P＜0.05），见图6。

图6 各组大鼠血清PINP、TRACP-5b 水平比较（A：PINP 水平比较；B：TRACP-5b 水平比较）

2.2.4 各组大鼠血清E2、FSH 比较 各组大鼠血清E2、FSH 水平比较，差异均有统计学意义（F=51.258、53.867，均P＜0.001）。与假手术组比较，模型组、益癸方汤组、戊酸雌二醇组、益癸方汤+戊酸雌二醇组大鼠血清E2水平均降低，FSH 水平均升高，差异均有统计学意义（均P＜0.05）。与模型组比较，益癸方汤组、戊酸雌二醇组、益癸方汤+戊酸雌二醇组E2水平均升高，FSH 水平均降低，差异均有统计学意义（均P＜0.05），见图7。

图7 各组大鼠血清E2、FSH 水平比较（A：E2水平比较；B：FSH水平比较）

2.2.5 各组大鼠股骨组织中STAT3、JAK、Akt 蛋白表达水平比较 各组大鼠股骨组织中STAT3、JAK、Akt 蛋白表达水平比较差异均有统计学意义（F=8 021.218、1 580.567、1 744.77，均P＜0.001）。与假手术组比较，模型组、益癸方汤组、戊酸雌二醇组、益癸方汤+戊酸雌二醇组大鼠股骨组织中STAT3、JAK、Akt 蛋白表达水平均升高，差异均有统计学意义（均P＜0.05）。与模型组比较，益癸方汤组、戊酸雌二醇组、益癸方汤+戊酸雌二醇组大鼠股骨组织中STAT3、JAK、Akt 蛋白表达水平均降低，差异均有统计学意义（均P＜0.05），见图8。

图8 各组大鼠股骨组织中STAT3、JAK、Akt 蛋白表达水平比较（A：蛋白表达的电泳图；B：STAT3 蛋白表达水平比较；C：JAK 蛋白表达水平比较；D：Akt 蛋白表达水平比较）

3 讨论

本研究通过实验探究益癸方汤对去卵巢大鼠模型的骨量保护作用，结果显示该方剂可提高大鼠体内E2水平、降低FSH 水平，骨代谢指标中PINP 升高、TRACP-5b 降低，以及股骨微细结构骨量改善，验证该方剂可预防去卵巢大鼠的骨质疏松，在网络药理学基础上筛选出STAT3、JAK、Akt 靶点，通过实验进一步验证了益癸方汤的作用机制可能通过下调STAT3、JAK、Akt 蛋白的表达发挥作用。

PMOP 的发生与女性雌激素水平下降有关，网络药理学分析益癸方汤中可能含有槲皮素、木犀草素、丹参酮、柚皮素、谷甾醇等多种化合物。已有研究证实口服槲皮素能够部分逆转动物模型中的骨质减少，其可能通过抗氧化、抗炎、促进成骨细胞、抑制破骨细胞发挥作用[6]。Kim 等[7]研究表明木犀草素显著降低了骨髓单核细胞和Raw264.7 细胞向破骨细胞的分化，还抑制分化破骨细胞的骨吸收活性。也有研究证明丹参酮ⅡA 没有改变NF-κB 受体激活剂或巨噬细胞集落刺激因子受体的表达，而是可能抑制NF-κB 受体激活剂配体诱导的破骨细胞分化[8]。本研究筛选出MAPK3、Akt1、TNF、IL-1β、TP53 等靶点，结合KEGG 通路分析，寻找到Akt 靶点和PI3K/Akt 信号通路相关联。本研究发现，与模型组比较，益癸方汤组、戊酸雌二醇组、益癸方汤+戊酸雌二醇组大鼠股骨组织中JAK、STAT3、Akt 表达水平均降低，提示益癸方汤可能通过该通路影响骨量作用。PI3K/Akt 信号通路通过介导生长因子信号传导到有机过程和关键细胞过程，如葡萄糖稳态、脂质代谢、蛋白质合成以及细胞增殖和存活[9]。细胞对雌激素的反应由雌激素受体与雌激素反应元件的结合和信号转导途径的激活等非核作用介导，雌激素还和PI3K/Akt 信号通路有关，数据表明17-E2可通过非核作用激活子宫内膜癌细胞系中的PI3K/Akt 信号通路[10]。PI3K/Akt 通路还影响了氧化应激过程，促进氧化损伤后细胞存活中发挥着关键作用[11]。JAK/STAT 途径是细胞因子信号传导的最重要途径之一，它不仅参与炎症，还与细胞增殖、分化、凋亡和免疫调节有关[12]。研究发现当JAK/STAT 通路被激活时，可以进一步激活MAPK 和Runt 相关转录因子2 信号传导并促进成骨分化[13]。一些黄酮类化合物可以发挥成骨分化作用，如槲皮素可作用于Akt1 靶点，并通过激活PI3K/Akt 信号通路促进骨髓间充质干细胞的成骨分化[14]。

综上所述，益癸方汤中的槲皮素、木犀草素、丹参酮、柚皮素、谷甾醇等多种有效成分可能通过作用于PI3K/Akt、JAK/STAT 信号通路防治PMOP，为中草药防治POMP 增加了理论基础。