耐碳青霉烯类铜绿假单胞菌现状及耐药机制分析

丁金蓉,李小彬,王蔚,翁育清

铜绿假单胞菌分布广泛,具有极强的环境适应能力,是常见医院内获得性感染的重要条件致病菌[1]。因其对多种抗菌药物存在天然耐药以及容易获得性耐药,导致可选用的抗菌药物越来越少,且随着人口老龄化、恶性肿瘤放化疗、介入性诊疗技术的发展、临床上广谱强效抗菌药物的大量应用、免疫缺陷宿主的增加、抗生素不合理使用和异质性耐药情况的发生,逐渐出现多药耐药或泛药耐药现象,给临床治疗带来更大困难[2]。碳青霉烯类革兰阴性杆菌检出率在全球范围内呈逐年增高趋势,临床抗感染治疗常面临无药可用的困境,疾病负担重,成为中国乃至世界最重要的公共卫生问题之一[3]。根据WHO 2017年所发表的《WHO PRIORITY PATHOGENS LIST FOR R&D OF NEW ANTIBIOTICS》,耐碳青霉烯类铜绿假单胞菌(CRPA)被纳入对人类健康构成最大威胁的12种耐药菌目录中,并列为最高级别1-,说明铜绿假单胞菌的严重耐药性已对人们健康造成巨大威胁。

1 国内耐药菌分布情况

根据2020年CHINET中国细菌耐药监测网收集全国52所医院临床分离菌共251 135株,其中革兰阴性菌占71.9%,前五位的细菌排名分别为大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌和鲍曼不动杆菌。其中铜绿假单胞菌对亚胺培南和美罗培南的耐药率分别为23.2%和19.3%[4]。

2 CRPA的流行病学特点及耐药机制概括

2.1 流行病学特点 根据各地耐药菌统计数据可看出,CRPA的样本搜集主要分布于医院的呼吸内科、重症监护室、神经外科、血液内科等科室[5-7]。铜绿假单胞菌主要分离自痰标本,且主要集中在住院周期长以及恶性肿瘤的放化疗、介入性诊疗技术操作比如插胃管、气管插管等患者。铜绿假单胞菌呈现出临床检出率高、科室分布广泛、耐药现象严重的特点,研究CRPA耐药机制有益于临床进一步治疗以及阻断其耐药传播[6]。

2.2 耐药机制

2.2.1 固有(自然)耐药性:固有可定义为一种细菌物种内普遍共有的特性,固有耐药性又称天然耐药性,由细菌染色体基因所决定,由自身基因产生的该种特有结构可对抗抗生素的某种作用机制,这类基因位置保守且与耐药相关,会随着基因传给下一代,不会轻易改变。与获得性耐药相比,固有耐药的研究报道较少,大多数人认为固有耐药机制研究相对清楚且只能垂直传播,常局限于个别种类的细菌。但近期有研究发现固有耐药与获得性耐药密切相关,甚至能被移动元件捕获进而可水平转移至其他细菌[8]。固有耐药的作用机制主要有膜的通透性、外排泵表达及酶的产生[9-11]。

2.2.2 碳青霉烯酶的产生:碳青霉烯酶的产生是碳青霉烯类抗生素耐药的一个主要原因,能通过化学修饰或水解碳青霉烯类抗菌药物等使大多数β-内酰胺抗菌药物包括碳青霉烯类抗生素失去活性[12]。β-内酰胺酶根据Ambler分类可分为A、B、C、D 4类,碳青霉烯酶是一种能水解碳青霉烯类的β-内酰胺酶,包括以丝氨酸为活性中心的A、D类和通过金属离子来抑制碳青霉烯类药物的β-内酰胺酶的B类[13]。

2.2.2.1 A类丝氨酸碳青霉烯酶:A类酶是一种丝氨酸酶,可利用活性中心的丝氨酸残基灭活β-内酰胺类药物,主要包括KPC、SME、GES酶家族[14]。对于CRPA,最值得关注的是GES酶,blaGES主要以基因盒的形式存在于耐药菌株的Ⅰ类整合子上,可通过结合转座子、质粒等可移动基因元件来获得水平转移能力,产生对碳青霉烯抗生素的水解活性[15-16]。

2.2.2.2 金属β-内酰胺酶(MBLs):B类酶是一类金属β-内酰胺酶,是细菌产生耐药性的主要机制之一[17-18]。目前国内外发现并报道的B类金属酶主要有NDM、VIM、IMP、SIM、GIM等,目前最为常见的包括IMP、NDM及VIM[19]。VIM型酶于1996年首次被发现,目前包含60种不同等位基因变异体。VIM-2是最常见的MBLs,主要存在于铜绿假单胞菌中,其他肠杆菌属也可见,其编码基因位于细菌染色体或质粒上,并常以基因盒形式存在于整合子中。López等[20]测量了亚胺培南、头孢他啶、头孢吡肟和哌拉西林对表达不同MBLs三种菌株的最低抑菌浓度(MIC),发现NDM-1在铜绿假单胞菌和鲍曼不动杆菌中抗性水平最高。多个试验都说明MBLs基因的存在和其产生的金属酶是铜绿假单胞菌对碳青霉烯类耐药的机制之一[21]。

2.2.2.3 D类酶碳青霉烯酶(OXA酶):现在已发现的OXA酶有400多种,其中OXA-48被广泛报道[22],但D类β-内酰胺酶最常在不动杆菌属中发现,主要在铜绿假单胞菌对其他抗菌药物的耐药机制中,而非碳青霉烯类抗菌药物。

2.2.3 细胞膜通透性下降:膜孔蛋白对细菌耐药性产生有十分重要的作用,一般细菌的细胞外膜上含有允许小分子蛋白通过的孔蛋白,其中允许抗生素通过的孔蛋白包括OprC、OprD、OprE、OprF、OprG 和OprH等,膜孔蛋白的数量决定了进入菌体的抗菌药物浓度,无论是数量减少还是缺失都会影响抗菌药物的进入从而使细菌产生一定耐药性。铜绿假单胞菌的外膜上分布OprC、OprD、OprE等具有孔道活性的蛋白[12]。OprD是一种孔径较小、且具有特异性的孔道蛋白,主要允许碳青霉烯类抗菌药物通过[23]。研究发现,耐碳青霉烯类铜绿假单胞菌中OprD基因表达降低甚至未检测到OprD基因表达,并发现部分CRPA中OprD基因发生突变,说明OprD在耐碳青霉烯类铜绿假单胞菌中起关键作用[24-25]。OprD孔蛋白减少可导致抗生素不能通过细胞外膜,降低铜绿假单胞菌对碳青霉烯类抗生素的渗透性,从而产生耐药性。同时有研究显示,在中国OprD的突变失活是铜绿假单胞菌对亚胺培南产生耐药性的主要原因[26-27]。

2.2.4 外排泵系统的表达:细菌外排泵系统可主动将菌体内的药物泵出到菌体外,使菌体内有效药物浓度降低,从而减弱抗菌药物作用,使细菌产生耐药性,这是CRPA的重要机制之一[28]。革兰阴性菌的三联多药外排系统由内膜转运蛋白、外膜通道和周质衔接蛋白组成[29-30]。目前研究报道与碳青霉烯类药物耐药的铜绿假单胞菌相关RND家族外排泵包括Mex AB-OprM、Mex CD-Opr J、MexXY-OprM等[31]。其中研究较透彻且被人们普遍验证接受的是Mex AB-OprM,Mex AB-OprM为周质融合蛋白(Mex A)、RND转运体(Mex B)和OprM的三聚体。当碳青霉烯类抗菌药物经外膜孔蛋白进入膜间隙后会被内膜分布的Mex B捕获,通过膜融合蛋白Mex A的桥联作用经外膜蛋白OprM排出菌体外,外排系统的高表达可引起亚胺培南和美罗培南两者的MIC值都升高。有研究对75株耐碳青霉烯类抗生素铜绿假单胞菌外排泵的作用进行研究并发现外排泵Mex AB-OprM的过度表达在CRPA中起重要作用。

2.2.5 青霉素结合蛋白(PBPs)的改变:PBPs是合成和重塑细菌肽聚糖细胞壁的主要催化剂,是细菌生长繁殖中不可或缺的酶。β-内酰胺抗生素可通过与PBPs结合,抑制PBPs酶活性,干扰细菌繁殖过程中细胞壁形成,并达到抗菌作用[32-33]。铜绿假单胞菌的PBP3是负责细胞壁肽聚糖合成的一种必需酶,可由β-内酰胺类抗生素共价灭活[34]。有研究指出,在对碳青霉烯类耐药的铜绿假单胞菌中可发现PBP3表达量降低,表明PBPs改变是CRPA的其中一个机制[35]。

2.2.6 细菌生物膜(BF)的形成:BF是指细菌附着于惰性物体或生物物体表面由细菌及自身分泌的胞外基质组成的细胞外聚合物。BF结构稳定,可帮助细菌逃避宿主免疫应答、抵挡抗菌药物的杀菌作用,从而对抗生素产生耐药。张艳芳等[36]通过研究发现亚胺培南耐药菌株的BF形成能力明显强于敏感菌株,说明BF的形成在铜绿假单胞菌对碳青霉烯类抗生素耐药产生过程中起到一定作用。Rossi等[37]对CRPA BF浓度测定的研究结果表明所有菌株均表现出较强BF形成能力,进一步表明BF产生在铜绿假单胞对碳青霉烯类抗生素耐药中发挥重要作用。

3 小结与展望

抗生素耐药性现已成为最大的公共卫生威胁之一。革兰阴性病原体严重威胁公众健康,同时碳青霉烯类抗生素作为临床抗感染治疗的一线药物也受到了巨大挑战。现由于细菌多药耐药性而无法治疗的感染在临床中越来越普遍。了解CRPA耐药机制及传播途径有助于为临床用药及预防、抗生素研究提供相应科学依据。

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