红花Aux/IAA基因家族鉴定及盐胁迫响应分析

刘湘楠 胡祥祥 乔梦燚 周丹宁 朱畇昊

摘要：为了对红花Aux/IAA基因家族进行生物信息学分析，研究该基因在红花生长发育中的调控作用，利用生物信息学方法，在红花全基因组中鉴定出28个Aux/IAA基因。根据其与拟南芥Aux/IAA基因的系統发育关系，使用MEGA 7.0做出系统发育进化树。经理化性质分析，红花Aux/IAA蛋白为亲水性蛋白，且79%位于细胞核中，大多数红花Aux/IAA蛋白表现为偏酸性；经聚类分析，将红花Aux/IAA基因分为5个亚族。基因结构分析表明，所有基因均含有 1～9个内含子。这些基因在红花的9条染色体上非均匀地分布，其中9号染色体上分布最多，有7个Aux/IAA基因。红花Aux/IAA基因在不同发育期及不同外源激素处理下表达量各不相同。对保守基序作图分析发现，大部分红花Aux/IAA 蛋白具有 4 个共同的保守基序，分别为motif 1、motif 2、motif 3、motif 4，qRT-PCR结果表明，不同浓度盐胁迫处理24 h后，基因CtAux/IAA1相对表达量呈上调趋势，推测此基因可能与提高红花抗盐胁迫能力有关。本研究结果将有助于了解红花Aux/IAA基因家族在生长发育过程中的功能并筛选优良基因。

关键词：红花；Aux/IAA基因家族；生物信息学分析；盐胁迫

中图分类号：S567.21⁺9.01  文献标志码：A

文章编号：1002-1302（2024）06-0068-09

收稿日期：2023-06-16

基金项目：国家自然科学基金（编号：81603232）；国家重点研发计划（编号：2017YFC1702800）；河南省重大科技专项（编号：171100310500）；河南省科技攻关项目（编号：172102310539）。

作者简介：刘湘楠（2000—），女，河南许昌人，硕士研究生，主要从事药用植物分子生物研究。E-mail：1296969180@qq.com。

通信作者：朱畇昊，博士，副教授，主要从事药用植物分子生物研究。E-mail：guxinhan123@163.com。

红花（Carthamus tinctorius L.）是《中华人民共和国药典》1963年版至2015年版收载药物，属常用中药，具有活血化瘀，通经止痛的功效^[1]。近年来，由于分子生物学技术的飞速发展，大多数中药材的药理成分和化学成分被深入研究，对红花进行基因信息分析已成为一个热门课题。截至目前，有关红花基因的生物学信息还很少见。

生长素普遍存在于所有植物中，参与到植物的各个生长发育阶段，其在植物细胞分裂、胚胎发育、建成形态、向性反应、加长休眠、顶端优势和组织分化等多种生长发育过程中发挥着极其重要的作用^[2]。Aux/IAA是生长素信号早期响应因子之一，被认为是最有活力和最重要的基因调节系统之一^[3]，其编码的蛋白质能通过与生长素响应因子特异性结合来调控生长素响应基因的表达，在整个植物生长素信号转导过程中具有重要作用^[4]。大多数Aux/IAA基因具有Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ共4个保守结构域，保守结构域Ⅰ含有保守的亮氨酸重复基序LxLxLx，抑制生长素下游调控基因；结构域Ⅱ是AUX/IAA不稳定的关键成分^[5]，存在高度保守序列（GWPPV）；结构域Ⅲ和Ⅳ含有与ARF相结合的位点，但这些结构域通常会有所缺失。

近年来，有关 Aux/IAA基因家族成员在某些植物中的作用已逐渐受到人们的关注，且有了较大的进展。此后针对Aux/IAA基因家族各个成员之间的关系、这些成员与其他家族基因的调节控制关系以及基因编码蛋白的调节控制作用及其协同作用的机制，它们与生长素之间的调控机制还有待深入探讨，这些都将有助于阐明植物生长发育的机制，为植物分子水平改良提供理论依据^[6]。

1  材料与方法

1.1  样品处理及试验地点

红花种子购自河北万草种业有限公司。种子采用土培，培养至真叶期18 d后，选取长势一致的红花幼苗，分别用蒸馏水以及100、200、300 mmol/L的NaCl溶液处理24 h 后取样，每个浓度5个生物学重复，做好标记，并立即放入液氮中速冻，储存于 -80 ℃ 冰箱。试验于2023年4月21日在河南中医药大学河南省道地药材生态种植工程技术研究中心进行。

1.2  试验材料

从Pfam数据库（http：//pfam.xfam.org/）中下载Aux/IAA结构域的HMM 模型文件（Pfam02309），基于HMM 模型，从红花基因组中检索得到候选Aux/IAA蛋白，使用Pfam数据库检索的结果整合、去冗余和去除不完整序列，共筛选出28个红花Aux/IAA基因。在文献[7]中查到拟南芥Aux/IAA基因家族的基因共29个。

1.3  试验方法

1.3.1  红花Aux/IAA蛋白的理化性质分析及亚细胞定位预测

对得到的红花Aux/IAA基因家族的候选序列，利用在线预测软件ORF Finder筛选具有全长核苷酸的红花Aux/IAA基因家族序列。通过ProtParam（https：//web.expasy.org/protparam/）软件在线对红花Aux/IAA基因家族蛋白的相对分子质量、等电点（pI）和亲水性平均系数（GRAVY）等指标进行预测；使用SOPMA （https：//prabi.ibcp.fr/htm/site/web/home）预测红花Aux/IAA蛋白二级结构；利用WoLF PSORT（https：//www.genscript.com/wolf-psort.html）软件分析红花Aux/IAA蛋白亚细胞定位。

1.3.2  红花Aux/IAA基因染色体定位分析

使用Mapchart软件，按照Aux/IAA基因家族每条染色体的长度和每个基因序列在红花染色体上的物理位置，对28个红花Aux/IAA基因进行染色体定位分析。

1.3.3  红花Aux/IAA基因家族系统进化树分析

在NCBI（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）下载拟南芥Aux/IAA基因家族的氨基酸序列共29个，用于进化分析。采用MEGA 7.0软件内置的Clustal W 算法对红花和拟南芥Aux/IAA基因家族的多个氨基酸序列进行比对，重复次数为500 次，其他参数使用默认值，将比对的结果构建系统发育树。

1.3.4  红花Aux/IAA基因家族基因结构分析

根据红花Aux/IAA基因家族的核苷酸序列与编码序列，使用GSDS网站（http：//gsds.gao-lab.org/）绘出红花Aux/IAA基因家族基因结构图。从基因组注释文件中下载红花Aux/IAA的基因结构注释信息，使用在线软件 MEME（http：//meme-suite.org/）将预测的基序数目设置为20，对红花Aux/IAA基因家族的保守基序进行预测与分析。使用TBtools将MEME预测结果可视化。

1.3.5  红花Aux/IAA基因家族蛋白互作网络分析

在STRING數据库输入28个红花Aux/IAA蛋白氨基酸序列，选择拟南芥进行同源比对，得出蛋白互作网络图（protein-protein interaction networks，PPI）。

1.3.6  红花Aux/IAA基因表达模式分析

从NCBI数据库下载红花Aux/IAA基因在不同外源激素诱导后以及5个时期（小芽期、中芽期、初花期、盛花期、衰花期）的基因表达数据，使用TBtools软件绘制28个红花Aux/IAA基因在不同外源激素处理下及5个发育时期的基因表达量热图。

1.3.7  红花Aux/IAA基因盐胁迫的表达分析

使用Trizol法提取不同浓度NaCl处理红花幼苗的RNA。使用BeyoRT^TMⅢcDNA第一链合成试剂盒对提取的RNA进行反转录得到红花幼苗 cDNA，置于-20 ℃冰箱保存。从28个红花Aux/IAA基因中挑选5个基因CtAux/IAA1、CtAux/IAA3、CtAux/IAA11、CtAux/IAA14、CtAux/IAA15，进行qRT-PCR验证，引物序列如表1所示，内参基因为Ct60s。采用康为UItraSYBR Mixture（Low ROX）两步法进行试验，2^-ΔΔC_T计算相对表达量，SPSS和Graph对计算结果进行分析并绘制柱状图。qRT-PCR反应体系：UItraSYBR Mixture qPCR Mix 10 μL，正反向引物各0.5 μL，cDNA 1.5 μL，双蒸水补至20 μL。qRT-PCR反应程序：95 ℃ 10 min；95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，40个循环；95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，95 ℃ 15 s。

2  结果与分析

2.1  红花Aux/IAA基因序列的鉴定及结构特征

利用BLAST在线分析软件对红花基因组数据库进行同源序列比对，筛选出含有全长的核苷酸序列，最终在红花中鉴定获得Aux/IAA基因28个（表2）。

2.2  红花Aux/IAA蛋白的理化性质及蛋白特性分析

红花Aux/IAA蛋白的理化性质分析结果（表2）表明，28个红花Aux/IAA蛋白氨基酸长度为 150～427 aa；平均相对分子质量为26.106 09 ku；其理论等电点平均值为 6.92，说明大多数红花Aux/IAA蛋白表现为偏酸性。其中27个红花Aux/IAA蛋白的亲水性平均系数均小于零，说明27个红花Aux/IAA蛋白属于亲水性蛋白。利用PSORT软件得出红花Aux/IAA蛋白的亚细胞定位，结果（表2）显示，红花Aux/IAA蛋白可能主要分布在细胞核、细胞质、叶绿体中。其中，79%红花Aux/IAA蛋白被定位于细胞核，这表明红花Aux/IAA蛋白可能在细胞核中起作用。

2.3  红花Aux/IAA基因染色体定位分析

利用红花基因组信息，绘制Aux/IAA基因在染色体上的位置，如图1所示，9条染色体上非均匀地分布着28个基因，其中1号染色体上分布的基因最少，只有一个CtAux/IAA8，9号染色体上分布的基因最多，有7个基因，基因CtAux/IAA22、CtAux/IAA23、CtAux/IAA24、CtAux/IAA25在9号染色体上形成基因簇。2号、6号和11号染色体上均只有2个Aux/IAA基因；有3条Aux/IAA基因分布于3号和12号染色体上。

2.4  红花Aux/IAA基因家族系统进化树分析

将29个拟南芥和30个红花的蛋白序列进行多序列比对，结果表明，红花和拟南芥的Aux/IAA 蛋白共可分为5个亚类，分别命名为 A、B、C、D、E组（图2）。每组包含的2种植物基因家族蛋白数各不相同，同一个亚组中蛋白的同源性较高。

2.5  红花Aux/IAA基因结构分析

已有研究显示，基因结构的多样性是众多基因

家族演化的动力^[8]。进一步对红花Aux/IAA基因结构进行分析，研究其结构的多样性。结果显示，所有基因均含有1～9个内含子。基因CtAux/IAA19的内含子最多，为9个。根据进化树结果（图3）显示，同一亚组的基因具有相似的基因结构，比如，基因CtAux/IAA1、CtAux/IAA6、CtAux/IAA28的结构相似，且都在亚组D。对红花Aux/IAA保守基序分析发现，大多数（20个）红花Aux/IAA 蛋白序列包含 4 个保守基序：motif1、motif2、motif3和 motif4，其余8个红花Aux/IAA蛋白序列均有缺失，这种有缺失的基因被称为非标准类型Aux/IAA基因^[9]。结构域缺失或突变现象，可能会导致基因功能异常^[10]。28个红花Aux/IAA蛋白中有 1个缺失 motif1，4个缺失 motif2，2个缺失 motif3，4个缺失 motif4。在保守基序分布相似的基因在进化树中也聚在一起，表明保守基序相似基因的结构功能也相似，例如，motif10只存在于基因CtAux/IAA11、CtAux/IAA12中，而这2个基因经聚类分析都在亚组D。除了4种典型的保守基序外，红花Aux/IAA 蛋白还存在其他 6 种保守基序，各成员间保守基序的重叠与差异某种程度上能反映它们的功能特征^[11]。由图4可知，大多数Aux/IAA基因具有Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ共4个保守结构域，保守结构域Ⅰ含有保守的亮氨酸重复基序LxLxLx；结构域Ⅱ存在高度保守序列（GWPPV）；结构域Ⅲ和Ⅳ含有与ARF相结合的位点，但这些结构域通常会有所缺失。

2.6  红花Aux/IAA基因家族蛋白互作网络分析

由图5可知，蛋白SHY2、AXR3与红花Aux/IAA蛋白具有相互作用。AXR可能在叶片老化过程中有调节控制作用^[12]；SHY2是作为生长素、细胞分裂素和油菜素内酯调控根分生组织发育的一个节点^[13]。其中，IAA19蛋白的互作通路最多，高达16条。红花Aux/IAA蛋白与这2种蛋白联系密切，推测红花Aux/IAA蛋白与其功能相似。

2.7  红花对Aux/IAA基因表达模式分析

使用TBtools软件绘制红花Aux/IAA基因在空白组和加入油菜素内酯（BR）、茉莉酸甲酯（MEJA）以及在5个时期的基因表达量热图。油菜素内酯是一种具有增加坐果率、促进作物生长、增大果实、增强作物耐寒能力、减轻药害、提高抗病能力作用的植物源植物生长调节剂。由图6-a可知，加BR后，基因CtAux/IAA1、CtAux/IAA4、CtAux/IAA5、CtAux/IAA26表达量增幅较大，表明这些基因可能最先与BR响应从而增强红花抗逆性，而基因CtAux/IAA10、CtAux/IAA24、CtAux/IAA27在加入BR后表达量均大幅下降，可能是BR响应抑制了这些基因的表达。MEJA的外源使用可刺激植物防御基因的表达，诱导植物的化学防御，其作用类似于机械伤害和昆虫取食。在加入MEJA后，基因CtAux/IAA3、CtAux/IAA5、CtAux/IAA8、CtAux/IAA16、CtAux/IAA19表达量较空白组有所增加，而基因CtAux/IAA2、CtAux/IAA7、CtAux/IAA11、CtAux/IAA13、CtAux/IAA14、CtAux/IAA15、CtAux/IAA21、CtAux/IAA26、CtAux/IAA27表达量大幅降低，基因CtAux/IAA17始终不表达，表明这个基因可能不参与BR、MEJA的相应过程。

由图6-b可知，几乎全部Aux/IAA基因在植物生长的5个时期均有表达，基因CtAux/IAA18仅在小芽期有非常微量的表达，而基因CtAux/IAA7、CtAux/IAA19在衰花期表达水平较高，从小芽期直到衰花期基因CtAux/IAA3的表达量几乎都比其他基因高，基因CtAux/IAA2、CtAux/IAA11、CtAux/IAA13、CtAux/IAA14、CtAux/IAA26的表达量均在盛花期达到最高值，据此可以找出7个高表达的基因，分别为

CtAux/IAA2、CtAux/IAA3、CtAux/IAA7、CtAux/IAA11、CtAux/IAA13、CtAux/IAA14、CtAux/IAA26，可以为更深入的红花Aux/IAA基因家族生长机制研究提供依据。

2.8  红花Aux/IAA基因盐胁迫的表达分析

为研究红花Aux/IAA基因在不同浓度盐胁迫下的表达水平，本研究选取不同亚组中表达量较高的5个基因，用q-PCR检测这5个基因在不同浓度NaCl胁迫下的表达量。由图7可知，在盐胁迫下，5个基因的表达量存在差异，CtAux/IAA3的表达量随着盐浓度的升高呈下调趋势，说明盐胁迫抑制了该基因的表达，CtAux/IAA1在200 mmol/L NaCl处理下的相对表达量最高，响应了盐胁迫，推测此基因可以提高红花的抗盐能力，但其响应胁迫机制待研究。

3  结论与讨论

Aux/IAA基因家族在植物生长素的响应途径中发挥着关键作用。最早从大豆受生长素诱导的基因中分离得到Aux/IAA基因，之后更多物种Aux/IAA基因家族的理化性质及特异性功能得到挖掘与鉴定。对其他物种Aux/IAA基因家族的研究表明，该基因家族在不同物种内的数量不一^[14]，包括在拟南芥中发现了29个Aux/IAA基因家族成员，在桃^[15]、大白菜^[16]、 黄瓜^[17]、高粱^[18]、粗山羊草^[19]中分别发现了22、59、28、25、28 个Aux/IAA基因家族成员，不同基因家族成员在植物生长发育过程中具有不同的功能，例如杨树中PtrI AA14.1的突变会产生叶片卷曲、分枝增多、育性下降等表型^[20]；在拟南芥中稳定表达桉树IAA4基因会造成根系向地性消失，茎木质部纤维消失，木质部维管发育受阻，束间纤维发育迟缓^[21]。水稻IAA13基因影响根系的发育，iaa13突变体中侧根的数量下降，组成性通气组织数量减少^[22]。

为了更好地理解红花生长素的响应途径，揭示Aux/IAA基因家族在红花生长发育和和抗逆境胁迫中的功能^[23]。本试验对红花Aux/IAA基因家族进行了分析研究，共鉴定到28個红花Aux/IAA家族基因，与拟南芥中的Aux/IAA家族成员数量基本一致。根据系统发育树分析，这57个家族成员可分为5个亚组，同一组中大多数Aux/IAA基因的结构都非常相似，少数基因的结构有特异性。Aux/IAA基因家族编码的蛋白一般由4个保守基序组成。经染色体定位图分析，9号染色体上端有4个基因形成的基因簇，可能是由于串联复制导致了基因家族的扩张^[24]。通过基因结构分析，发现所有基因均含有 1～9个内含子。在BR和MEJA的胁迫下，各基因的相对表达量发生变化，表明红花Aux/IAA基因在响应BR和MEJA胁迫过程中具有重要作用。根据红花Aux/IAA基因家族的表达热图，找到了7个高表达基因，它们可能在红花的整个生长发育过程中起重要作用。qRT-PCR结果表明，CtAux/IAA1可能有提高红花抗盐胁迫的能力。这些发现将有助于进一步分析红花Aux/IAA基因在生长发育过程中的功能。

随着分子生物信息学和中医药的快速发展，许多中药材的基因信息解析逐步成为研究的热点。但是对于红花Aux/IAA基因家族生物信息学分析较少，红花Aux/IAA家族成员在红花生长发育过程中的调控机制尚不明确。因此，本研究通过生物信息学分析红花Aux/IAA基因家族的基因结构等，鉴定红花基因组中的Aux/IAA基因家族成员并分析它们的理化性质、保守基序、基因结构、蛋白互作网络、表达模式、盐胁迫等，了解到Aux/IAA家族基因在整个红花生长素信号转导过程中具有重要作用。本研究可为深入了解红花Aux/IAA基因家族在生长发育过程中的功能及分子育种筛选优良基因提供一定的理论依据^[25]。

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