基于血清药物化学的乌蕨效用成分研究

黄斌　吴先昊　赵诗云　李雪　胡燕珍　张媛媛　陈乐

【摘 要】 目的：对乌蕨活性部位进行血清药物化学研究，分析其体内入血成分。方法：采用UPLC-Q-TOF-MS/MS技术，通过对比浸膏、空白血清和含药血清的图谱差异，解析乌蕨活性部位浸膏经大鼠灌胃后血清中的原型成分和代谢产物。结果：从血清中鉴定了30个吸收入血成分，其中3个为原型成分，27个为代谢产物。结论：该研究较为全面的阐释了乌蕨抗炎活性部位在大鼠血中的移行成分，为进一步研究其药效物质基础和作用机制奠定基础。

【关键词】 乌蕨；血清药物化学；抗炎；UPLC-Q-TOF-MS/MS

【中图分类号】R28 【文献标志码】 A【文章编号】1007-8517（2024）05-0055-06

DOI：10.3969/j.issn.1007-8517.2024.05.zgmzmjyyzz202405011

Study on Effective Components of Stenoloma Chusanum Based on Serum Medicinal Chemistry

HUANG Bin，2 WU Xianhao ZHAO Shiyun LI Xue HU Yanzhen，2 ZHANG Yuanyuan，2 CHEN Le，2*

Abstract：Objective To study the serum medicinal chemistry of the active part of Stenoloma chusanum and analyze its blood entering components in vivo. Methods UPLC-Q-TOF-MS/MS technology was used to analyze the prototype components and metabolites in the serum of the active fraction extract of Stenoloma chusanum after intragastric administration in rats by comparing the differences in the chromatograms of the extract， blank serum， and medicated serum.Result 30 absorbed components were identified from the serum， of which 3 were prototype components and 27 were metabolites. Conclusion This study provides a comprehensive explanation of the migration components of the anti-inflammatory active site of the Stenoloma chusanum in rat blood， laying the foundation for further research on its pharmacological substance basis and mechanism of action.

Keywords：Stenoloma Chusanum; Serum Pharmacochemistry；Anti-inflammatory；UPLC-Q-TOF-MS/MS

乌蕨（Stenoloma chusanum Ching）又称乌韭、苦黄连、大叶金花草等，为陵齿蕨科乌蕨属多年生草本植物［1］。乌蕨中以黄酮类、有机酸类化合物为主要成分，研究表明乌蕨具有保肝、降血糖、抗炎、抗菌、抗肿瘤、抗氧化、解毒等作用［2-3］，《江西草药》《中药大辞典》《贵州中草药名录》、广西中药志》等都记载乌蕨用来治疗痢疾、烫伤、支气管炎、肝炎、黄疸等疾病。临床上主要用于治疗小儿细菌性或病毒性感染，如支气管炎、肺炎、扁桃体炎及肠胃炎等疾病［4］。

文献表明乌蕨乙酸乙酯部位提取物能显著抑制二甲苯所致小鼠耳廓肿胀［5］；本课题组前期对乌蕨抗炎活性筛选发现，乌蕨乙酸乙酯部位可显著改善大鼠急性咽喉炎症状［6］，本实验旨在研究乌蕨抗炎活性物质基础，采用UPLC-Q-TOF-MS/MS技术分析乌蕨乙酸乙酯部位血中移行成分，为进一步探讨乌蕨抗炎機制通路奠定基础。

1 仪器与材料

1.1 仪器 AB-Sciex 5600系列LC/MS Trap型质谱仪，Waters C18色谱柱（2.1 mm×100 mm，1.7 μm），PeakView 1.2软件；TDL-80-2B低速离心机、TCL-16G台式离心机（上海安亭科学仪器厂）；XW-80A涡旋混合器（上海青浦沪西仪器厂）。

1.2 材料 原儿茶酸、原儿茶醛、牡荆素、木犀草苷、秦皮乙素、牡荆素葡萄糖苷（批号分别为110809-201906，110810-201608，111687-201704，11720-201106，741-200105，111979-201501，均购自中国食品药品检定研究院），荭草苷（批号：B20509，上海源叶生物科技有限公司）。健康雄性SPF级SD大鼠（180±20）g购于江西中医药大学，许可证号CCXK（赣）2018-0003。

2 方法

2.1 供试品溶液的制备 取乌蕨药材1 kg，按料液比1∶15，用60%乙醇溶液回流提取3次，浓缩成浸膏，加适量水混悬，依次用石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇进行萃取，最后得乙酸乙酯部位浸膏31.2 g，加蒸馏水适量制备成生药量为2 g/mL的混悬液，冷藏备用。

2.2 对照品溶液的制备 分别精密称取各对照品适量，制备成浓度约为40 μg/mL的混合对照品溶液，经0.22 μm微孔滤膜过滤，即得。

2.3 空白血清及含药血清的制备 取雄性SD大鼠12只，随机分为空白组和给药组，每组6只，适应性饲养一周，实验前禁食12 h，全程不禁水。空白组给予蒸馏水灌胃，给药组均按20 g/kg生药量进行灌胃给药，早晚各一次，连续给药3天，最后一次给药后，分别于60 min、120 min、240 min，从大鼠股动脉放血，静置30 min，离心10 min（4000 r/min），吸取上清液，即得血清供试品，于-80 ℃冰箱存储备用。

2.4 含药血清样品的处理 各时间点分别取200 μL血清样品并混合，得600 μL混合血清样本，加入3倍量的乙腈，涡旋混合3 min，离心10 min（12000 r/min），取上清液，重复操作一次，上清液置EP管中，37 ℃水浴下氮气吹干，残渣用200 μL甲醇复溶，经0.22 μm微孔滤膜过滤，即得。

2.5 色谱条件 色谱柱为Waters C18色谱柱（2.1 mm×100 mm，1.7 μm），流动相为乙腈（A）-0.2%甲酸溶液（B），梯度洗脱（0～20 min，5%～30% A；20～25 min，30%～100% A；25～30 min，100%-100% A）柱温为40 ℃，进样量为2 μL，流速为0.25 mL/min。

2.6 质谱条件 电喷雾离子源（ESI），扫描方式为负离子模式（ESI-，M/Z：100-1250 Da）；喷雾电压（IS）为-4500 V，雾化气温度（TEM）为500 ℃，气帘气（CUR）为40.00 Psi，雾化气（GS1）为50.00 Psi，辅助加热气（GS2）为50.00 Psi，去簇电压（DP）为-100 V，碰撞能量（CE）为-40 V，碰撞能量叠加（CES）为15 V。

3 结果

通过UPLC-Q-TOF-MS/MS检测，并经过与对照品、文献相关数据比对，初步鉴定30种血中移行成分，其中3个为原型成分，27个为代谢产物，鉴定结果见表1，各样品总离子流图如图1所示。

3.1 入血原型成分的解析 化合物2在负离子模式下其准分子离子峰为m/z 153［M-H］-，二级碎片m/z 109［M-H-CO2］-，m/z108 ［M-H-HCO2］-，与对照品及文献［7］比對，鉴定为原儿茶酸。化合物13在负离子模式下其准分子离子峰为m/z 179［M-H］-，二级碎片 m/z 135［M-H-CO2］-，m/z134 ［M-H-HCO2］-，与文献［7］比对，鉴定为咖啡酸。

3.2 代谢产物的解析 原儿茶酸代谢途径分析：化合物1在负离子模式下其准分子离子峰为m/z 233［M-H］-，二级碎片m/z 153［M-H-SO3］-，m/z 109［M-H-SO3-CO2］-；化合物3在负离子模式下其准分子离子峰为m/z 329［M-H］-，二级碎片m/z 153［M-H-GluA］-，m/z 109［M-H-GluA-CO2］-；化合物6在负离子模式下其准分子离子峰为m/z 247［M-H］-，二级碎片m/z 167［M-H-SO3］-，m/z 152［M-H-SO3-CH3］-，m/z 108［M-H-SO3-CH3-CO2］-；化合物7在负离子模式下其准分子离子峰为为m/z 189［M-H］-，二级碎片m/z 109［M-H-SO3］-，m/z 108［M-2H-SO3］-，m/z 153，m/z 109，m/z 108为原儿茶酸的特征碎片离子，结合参考文献［8］，推测化合物1为原儿茶酸硫酸化产物，化合物3为原儿茶酸葡萄糖醛酸化产物，化合物6为原儿茶酸甲基化和硫酸化产物，化合物7为原儿茶酸脱羧后的硫酸化产物。代谢途径如图2所示。

木犀草素代谢途径分析：化合物23在负离子模式下其准分子离子峰为m/z 637［M-H］-，二级碎片m/z 461［M-H-GluA］-，m/z 285［M-H-GluA-GluA］-；化合物25在负离子模式下其准分子离子峰为m/z 475［M-H］-，二级碎片m/z 299［M-H-GluA］-，m/z 284［M-H-GluA-CH3］-；化合物26在负离子模式下其准分子离子峰为m/z 541［M-H］-，二级碎片m/z 461［M-H-SO3］-，m/z 285［M-H-SO3-GluA］-。m/z 285为木犀草素的特征离子，结合参考文献［9］，推测化合物23为木犀草素双葡萄糖醛酸化产物，化合物25为木犀草素甲基化和葡萄糖醛酸化产物，化合物26为木犀草素硫酸化和葡萄糖醛酸化产物。代谢途径如图3所示。

4 讨论

中药成分复杂，不同成分的体内过程具有不同的药动学特征，为了更全面表征乌蕨乙酸乙酯部位的血中移行成分，结合文献［10-11］选择将60 min、120 min、240 min的血清样本混合进行分析；同时比较了乙腈和甲醇对血清样本的除杂效果，发现乙腈沉淀效果明显强于甲醇；目前对乌蕨质量控制的研究多以原儿茶酸、原儿茶醛、荭草苷、牡荆素鼠李糖苷、牡荆素葡萄糖苷、牡荆素、木犀草苷等为主要指标性成分，本次对乌蕨乙酸乙酯部位浸膏灌胃大鼠血清中移行成分研究中发现原儿茶酸、原儿茶醛、木犀草素相关代谢产物，未发现荭草苷、牡荆素、牡荆素鼠李糖苷、牡荆素葡萄糖苷原型成分及相关代谢产物，文献［12-14］表明牡荆素等黄酮碳苷首过效应明显，胃肠吸收弱，半衰期短，导致选取的目标时间点不合适。

本研究基于中药血清药物化学理论和UPLC-Q-TOF-MS/MS技术探讨乌蕨乙酸乙酯部位浸膏灌胃大鼠血清中移行成分，共推断了3个原型成分和27个代谢产物，以原儿茶酸、咖啡酸、香草酸、木犀草素代谢产物为主，其代谢类型主要是甲基化、葡萄糖醛酸化、硫酸化等二相代谢。同时可推断原儿茶酸、木犀草素等为乌蕨主要抗炎药效成分，与文献资料相吻合，为研究乌蕨药效物质基础奠定基础。

参考文献

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（收稿日期：2023-06-01 编辑：杜玲玉珊）

基金项目：江西省中医药管理局科技计划项目（2019A228）； 江西省中医药中青年骨干人才（第四批）培养计划（赣中医药科教字［2020］6号）。

作者简介：黄斌（1990—），男，汉族，硕士，助理研究员，研究方向为中药分析。E-mail：3279844869@qq.com

通信作者：陈乐（1982—），女，汉族，硕士，研究员，研究方向为中药分析。E-mail：76349830@qq.com