环状RNA在草食家畜肌肉中的研究进展

吴子贤，李蕴华，田 瑛，李秀男，赵艳红，刘佳森

（1.内蒙古自治区农牧业科学院畜牧研究所，呼和浩特 010031；2.内蒙古农业大学动物科学学院，呼和浩特 010018）

家畜肌肉的生长发育是一个复杂的、多阶段的过程，受多种因素尤其是肌肉发育相关基因的调控。近年来的研究发现，环状RNA（circRNAs）广泛参与细胞增殖、细胞分化和机体发育（包括肌肉发育）。有关circRNA 对家畜肌肉发育的影响目前已成为该领域的研究热点。本文简要介绍了circRNAs 的发现、功能以及在家畜肌肉发育中的影响，以期为丰富家畜育种和提高家畜经济性状提供参考。

1 circRNA的发现

circRNAs是一类由非规范剪接事件产生的非编码RNA，被称为反剪接。在反向剪接过程中，下游的剪接供体位点与上游的剪接受体位点共价连接。circRNA是一种闭合环状RNA，可以稳定存在于生物体中，但它不具有5’端帽结构和3’端聚（a）尾结构［1］。早在20世纪七八十年代，研究者就在Nature 和PANs 中提出circRNA 是一种共价封闭的环状RNA 分子。根据circRNA 的序列组成，可将其分为3 种类型：外显子来源的circRNA，内含子来源的circRNA 和外显子-内含子circRNA。Cao 等［2］在羊的骨骼肌环状RNA 文库中发现了886种内含子和外显子形式的环状RNA，其中大多数circRNA 和参与肌肉生长发育的肌肉特异性miRNA相互作用，尤其是circ776。但是，关于其他类型的circRNA 调节肌肉发育的报道很少。因此，需要进一步研究和突破。

2 circRNA的功能

circRNA 长期以来被认为是具有调节效力的非编码RNA（ncRNAs）［3］，可以在其合成位点与宿主基因结合，并通过形成RNA-DNA 杂合体（R 环结构）导致转录暂停或终止，从而上调外显子跳过或截短转录本。大量的研究证实，circRNA 通过充当ceRNA 或miR 海绵发挥生物学功能［4-5］。但鉴于circRNA 丰度普遍较低，结合位点数量有限，circRNA 如何检测及怎样充分发挥作用尚不清楚。Schuller 等［6］认为，circRNAs 也可以与蛋白质相互作用，其翻译过程由核糖体完成，涉及起始、延伸、终止和核糖体循环。Zhao 等［7］研究发现，真核mRNAs 的起始包括从5'cap 近端连接点到起始密码子的43s 预起始复合物的扫描，然后是核糖体亚单位连接和因子置换。由于缺乏5'帽和3'尾，circRNA只能采用不依赖帽的方式，由circRNA 编码的肽通常被截断，其功能大部分类似于全长蛋白质对应物（circFBXW7-185aa）［8］。然而，一些源自circRNA 的蛋白质发挥的功能独立于宿主基因，甚至与宿主基因产物的功能相反（circFNDC3B-218aa）［9］。该结果拓宽了人类蛋白质组的范围。然而，circRNA 翻译的调控机制以及延伸和终止的过程仍不完全清楚。

3 circRNA对家畜肌肉发育的影响

肌肉发育是一个非常复杂的生物学过程，主要依赖于肌纤维细胞的增殖和肥大［10］。研究表明，肌纤维的数量只在出生前增加，出生后变化不大，而且肌纤维的生长依赖于肌纤维的肥大［11］。肌纤维的肥大包括两个方面：一是肌原纤维增多，二是肌纤维中的细胞核数目增多［12］。成肌细胞分化的生理过程，受包括PUR 蛋白家族在内的复杂分子网络调控。PUR蛋白家族由转录因子富含嘌呤元件结合蛋白α（Purine-rich element binding protein alpha，PURα）和富含嘌呤元件结合蛋白β（Purine-rich element binding protein alpha，PURβ）组成，两者在形成肌管中起着重要作用。PURα 和PURβ可以结合到MHC 的启动子区域，抑制MHC 的转录和MHC蛋白的产生，从而抑制肌源性分化。circSamd4直接与PURα 和PURβ 结合，阻止其进入细胞核，间接促进肌肉细胞分化。肌肉发育是一个由多个基因调控的多步骤过程，它不仅受多种肌源性调控因子的调控，包括肌细胞生成素（Myogenin，MyoG）、肌源性调控因子-4（Cleregulatoryfactors-4，MRF-4）、肌球蛋白重链（Myosin heavy chain，MyhC）、成肌细胞调节因子家族成肌因子-5（Myogenic factor 5，Myf-5）、肌生长抑制素（Myostatin，MSTN）、肌细胞增强因子2A-D（Myocyte enhancer factor 2A-D，MEF2A-2D）、成肌分化抗原（Myogenic differentiation Antigen，MyoD）和配对盒（Paired box gene，Pax）家族成员Pax 3 和Pax 7［13］，也受其他相关基因的调控，如胰岛素样生长因子-I（Insulin-like growth factors-I，IGF-I）、胰岛素样生长因子-II（Insulin-like growth factors-II，IGF-II）、叉头盒转录因子01（Forkhead box O1，Fox01）和哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（Mechanistic target of rapamycin kinase，mTOR）［14］。此外，研究证实，影响肌肉发育的基因有两种调节作用：一种是正向促进，另一种是反向抑制［13，15-16］。这些生长因子在调节肌肉发育中发挥着独特的作用，可以调节肌肉中许多部位的细胞增殖、细胞凋亡、肌节激活和肌肉特异性基因谱系［17-18］。

据报道，动物肌肉和肌肉细胞中的circRNA 数量在2 000～37 000 之间［19-24］。在前人的研究中，许多circRNA 含有结合位点，如miR-1、miR-133、miR-206、miR-29、miR-378、miR-431［25］、miR-7［26］、miR-135a［27］、miR-1290［28］和miR-876-5p［29］，均在肌生成过程中参与细胞增殖、分化和信号转导。大量的证据还表明，家畜的肌肉发育确实受到circRNA 和miRNA 的调控。Shen 等［30］的研究证明，极少数circRNA 可以在转录和翻译水平调节家畜肌肉发育。然而，目前该领域几乎没有相关研究。因此，circRNA 以不同方式对肌肉发育的相关调控机制备受关注。

4 circRNA在家畜肌肉中的研究进展

4.1 在牛肌肉中的研究

Wei 等［22］的研究结果表明，circLMO7 可以通过竞争性结合miR-378a-3p，增强miR-378a-3p 靶基因HDAC4的表达，促进牛的肌细胞增殖，抑制成肌细胞的分化。Yan 等［31］通过建立RNA 序列文库，共鉴定了哈萨克牛和新疆褐牛背最长肌样本中的5 177 个circRNA，发现其中有46 个是差异表达的。差异表达基因的鉴定表明，肌肉发育过程与差异表达的circRNA有关。Wei等［22］首次检测了牛骨骼肌在两个发育时期（胚胎期和成年最长肌）的circRNA 表达谱，指出当miR-378a-3p 被下调、靶基因hdac4 被激活，从而促进了肌细胞的增殖，抑制肌细胞分化。Li等［32］研究发现，circFGFR4 和miR-107 在秦川牛胚胎期（90 d）和成年期（24 个月）的背最长肌中高表达，并且circFGFR4 可以吸附miR-107。MiR-107 可通过与过表达的circFGFR4 结合来削弱Wnt3a 的表达。可见Wnt3a 作为miR-107 的靶点，在抑制肌管形成和促进成肌细胞凋亡方面发挥着重要作用。综上所述，circFGFR4 可以作为miR-107 海绵消除miR-107 对Wnt3a 表达和牛原代成肌细胞分化的抑制作用。Wang 等［33］研究发现，circTTN 可通过与miR-432 竞争性结合激活IGF-II/磷脂酰肌醇3 激酶（PI3K）/AKT 信号通路，进而促进牛成肌细胞的增殖和分化。Li 等［32］研究发现，成年牛肌肉中的circFUT10可以通过竞争性结合miR-133a来降低其对靶基因的抑制作用，并且与肌肉发育相关的MyHC、MyoD和MyoG基因表达在mRNA 和蛋白质水平上与circFUT10 的表达同步变化。circ-FUT10 过表达可促进MyHC表达，诱导成肌细胞凋亡，促进成肌细胞分化。相反，circZfp609 与miR-194-5p 结合抑制bcl2相关转录因子1（BCLAF1）的表达，从而影响Myf5 和MyoG 的表达，抑制成肌细胞分化。circSNX29 广泛存在于牛的原代成肌细胞中，但其在胚胎骨骼肌中的表达水平明显高于在成年骨骼肌中的表达水平。Peng等［34］研究发现，circSNX29的过表达促进成肌细胞分化并抑制细胞增殖，而干扰circSNX29 会抑制成肌细胞分化并促进增殖。之后的生物信息学预测结果表明，circSNX29 可能吸附到miR-744 上，具有9 个潜在的结合位点。双荧光素酶检测结果表明，circSNX29可以直接竞争性结合miR-744，有效逆转miR-744 对Wnt5a和CaMK II 的抑制作用。通过KEGG 通路富集分析、Western blot、钙荧光探针和CamK II 活性检测，发现Wnt5a 和circSNX29 的过表达激活了非经典通路Wnt/Ca2+，通过增加CamK II 激酶的活性和PKC 的磷酸化水平，进而调节牛成肌细胞的增殖和分化。以上研究进一步表明，胚胎期的肌肉发育比成年期更有效。

4.2 在羊肌肉中的研究

Li等［20］的研究结果表明，在胚胎期和成年期哈萨克羊的背最长肌中均有6 113个差异表达的circRNA，circRNA 的母源基因主要富集在肌肉生长发育相关的信号通路中。其中oar_circ_0000385、oar_circ_0000582和oar_circ_0001099 在与肌肉发育相关的miRNA（miR-143、miR-133 和miR-23）上有多个结合位点；在绵羊成年背最长肌（LDM-A）和胚胎背最长肌（LDME）的RNA序列中共发现5 086个差异表达的circRNA。实时荧光定量PCR 结果表明，circRNA 0000552、circRNA 00002456、circRNA 00004666、circRNA00004676和circRNA 00004690 在LDM-E 中的表达量相对高于LDM-A。circRNA 0003451、circRNA 0005243、circRNA 0005250 和circRNA 0005256 在LDM-A 中的表达相对高于LDM-E，证明circRNA 在绵羊肌肉差异表达。Cao等［2］从绵羊骨骼肌RNA 基因库中提取了7 550 万个序列，这些序列被映射到绵羊参考基因组中的729个基因，共包含886个circRNA；同时，该研究使用RNA-seq研究了分娩前后绵羊背长肌中的circRNA，共检测到6 113个circRNA，其中部分circRNA（circRNA100、circRNA108、circRNA205、circRNA606、circRNA678、circRNA744 和circRNA776）含有至少两个与肌肉发育相关的miRNA保守靶点（miR-29b、miR-133、miR-208和miR-499）。

5 结语

circRNAs 是肌肉发育的新调节剂。然而，目前有关circRNA 的功能注释主要是预测和分析源编码基因或可能的miRNA 结合位点。当前的大多数研究都集中在通过ceRNA 共表达调控网络指导肌肉发育的circRNA 上。此外，一些研究证实circRNA 可以在转录和翻译中调节家畜肌肉发育，只有少数研究表明circRNA 可以直接调节家畜肌肉发育。因此，深入研究circRNA 的形成和类型以及与靶基因的作用机制，探索其生物学功能，对于了解生物体的生长发育和疾病治疗具有重要意义。由于circRNA 的多样性、作用模式的多样性以及研究方法的限制，尚需要一些时间来阐明这些基因及其调控机制。随着现代分子生物学技术、新一代测序技术的飞速发展，circRNA 还有其他方法可以调节牲畜的肌肉发育。