高效液相色谱法定量分析食用油中的黄曲霉毒素B1

乔佳璐 王丽

摘 要：目的：建立高效液相色谱测定食用油中黄曲霉毒素B1的方法。方法：样品用甲醇水提取，经黄曲霉毒素B1免疫亲和柱净化，用甲醇洗脱，洗脱液用柱后碘衍生法上机测定。结果：该方法线性回归方程为Y=27 217.3X，相关系数R2=0.999 6，回收率在96.8%～101.2%，方法重复性的RSD为0.6%，质控样的Z值为0.5，检出限为0.029 ?g·kg-1，定量限为0.098 ?g·kg-1。结论：该方法线性关系良好，回收率优良，质控样、检出限、定量限均符合要求，具有简单、快速、高效、节约试剂耗材的特点。

关键词：食用油；高效液相色谱法；黄曲霉毒素B1

Quantitative Determination of Aflatoxins B1 in Edible Oil by High Performance Liquid Chromatography

QIAO Jialu， WANG Li

（Baoji Food and Drug Testing Center， Baoji 721000， China）

Abstract： Objective： In order to establish the determination method of aflatoxins B1 in edible oil by high performance liquid chromatography. Method： The samples were extracted with methanol water， purified by aflatoxins B1 immunoaffinity column， eluted with methanol， and determined by post-column iodine derivatization. Result： The linear regression equation was Y=27 217.3X， the correlation coefficient was R2=0.999 6. The recovery rate of method was from 96.8% to 101.2%， the RSD of reproducibility was 0.6%， the Z value of quality control samples was 0.5， and the detection limit was 0.029 ?g·kg-1， the limit of quantification was 0.098 ?g·kg-1. Conclusion： The method has good linearity， good recovery， quality control sample， detection limit， quantitative limit are in line with the requirements， with simple， fast， efficient and save reagent consumables characteristics.

Keywords： edible oil; high performance liquid chromatograph; aflatoxins B1

黄曲霉毒素是一种由黄曲霉菌产生的真菌毒素，主要包括黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2等羟基化代谢产物[1]。其中，黄曲霉霉毒素B1的毒性最强，最为多见，是国家市场监督管理总局规定的大部分食品的必检项目之一。黄曲霉毒素B1普遍存在于花生油、菜籽油等食用油中，且以南方高温、高湿地区的食用油受污染最为严重[2]。黄曲霉毒素B1易溶于甲醇等有机溶剂，难溶于水，耐热耐高温，在食物中需要加热至280 ℃以上才会裂解，所以一般烹调温度下黄曲霉毒素B1难以被破坏。

黄曲霉毒素B1会对人体的肝脏、神经系统、免疫系统造成损伤，是世界公认的毒性最强、分布最广、危害最大的一类真菌毒素[3-4]，被世界卫生组织划定为Ⅰ类致癌物。我国食品安全国家标准中规定玉米油、花生油中黄曲霉毒素B1限量为20 μg·kg-1；其他食用植物油脂为10 μg·kg-1[5]。黄曲霉毒素B1的检测方法有很多种[6-8]，GB 5009.22—2016收纳的就有5种检测方法，分别为高效液相色谱-柱前衍生法、同位素稀释液相色谱串联质谱法、高效液相色谱-柱后衍生法、薄层色谱法、酶联免疫吸附筛查法[9]。本文主要针对国家标准中检测食用油的高效液相色谱-柱后衍生法进行优化，使得检测过程更加方便简洁，省时省力，为检测机构完成大批量检测任务提供便利。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

菜籽油，购买于宝鸡市华润万家超市高新店；甲醇、乙腈、正己烷，均为色谱纯，均采购于DIKMA；碘（I2），采购于天津科密欧试剂有限公司；黄曲霉毒素B1标准品（批号：1162-65-8，浓度100 ?g·mL-1，采购于坛墨质检科技有限公司；批号：SB05-195-2008，浓度2 ?g·mL-1，采购于农业农村部环境保护科研监测所）；黄曲霉毒素B1免疫亲和柱，采购于天津博纳艾杰尔科技有限公司；实验室用水为超纯水。

1.2 仪器与设备

LC-20A高效液相色谱仪（配备RF-20A熒光检测器、柱后衍生器），日本岛津公司；氮吹仪，无锡沃信仪器有限公司；电子天平（感量0.1 mg），赛多利斯科学仪器（北京）有限公司；旋涡混合器（VG3），IKA；固相萃取仪（AP-02B真空泵），天津奥特赛恩斯仪器有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 色谱条件

色谱柱：thermo UMISil C18柱（250 mm×4.6 mm，5 ?m）；流动相：甲醇-水（50+50）；发射波长：440 nm；激发波长：360 nm；流速：1.0 mL·min-1；柱温：35 ℃；衍生溶液：0.05%碘溶液；衍生液流速：0.2 mL·min-1。

1.3.2 标准溶液的配制

准确吸取1.0 mL黄曲霉毒素B1标准物质置于100 mL的容量瓶中，加乙腈定容至刻度，配制成浓度为1 ?g·mL-1的标准储备液，置于4 ℃冰箱中冷藏保存；取0.5 mL黄曲霉毒素B1标准储备液置于

50 mL容量瓶中，加流动相定容至刻度，配制成浓度为10 ng·mL-1的中间液；取一定体积的储备液及中间液，配制成浓度为0.1 ng·mL-1、0.5 ng·mL-1、

2.0 ng·mL-1、5.0 ng·mL-1、10.0 ng·mL-1、20.0 ng·mL-1和40.0 ng·mL-1的标准工作溶液。

1.3.3 样品提取及净化

准确称取混合均匀的试样5 g置于50 mL离心管中，加20 mL乙腈-水溶液（84+16），涡旋混合，超声提取20 min，以6 000 r·min-1的转速离心10 min，取4 mL上清液，加入12 mL超纯水，混合均匀，待过柱；将免疫亲和柱置于固相萃取装置上，弃去保护液，调节压力，使待测样液以2 mL·min-1的速度稳定下滴，滴完后，加入2×10 mL水，淋洗亲和柱，待水滴完后，抽干亲和柱；脱离真空系统，加2 mL甲醇洗脱，控制流速为2 mL·min-1，抽干亲和柱，收集全部洗脱液于玻璃试管中，过0.22 μm滤膜，滤液待测。

1.3.4 方法学验证分析

通过平行样品、质控样品、空白试验、加标试验以及重复性试验确定方法的准确度[10-11]。

2 结果与分析

2.1 标准品与溶剂的选择

分别用不同来源的浓度为2 ?g·mL-1、100 ?g·mL-1的黄曲霉毒素B1标准物质绘制的标准曲线，加载质控样，进行数据分析。结果显示，标准物质浓度越大，储存过程中损失越小，质控样结果越准确。因此，实验过程中应该购买浓度大的标准物质。黄曲霉毒素B1标准品（浓度为5 ng·mL-1）的液相色谱图见图1。

2.2 液相色谱条件的确定

实验中分别使用不同比例（30∶70、40∶60、45∶55、50∶50）的甲醇-水作为流动相进行检测，结果显示，当甲醇-水比例为50∶50时，目标峰峰形对称，样品中杂质干扰影响小。样品的液相色谱图见图2，空白试验的液相色谱图见图3。

2.3 线性关系分析结果

参照1.3.1中的色谱条件对系列不同质量浓度的黄曲霉毒素B1标准工作溶液进样分析，以浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线。结果显示，黄曲霉毒素B1线性回归方程为Y=27 217.3X，相关系数R2=0.999 6，线性关系良好。黄曲霉毒素B1的线性关系图见图4。

2.4 方法学验证分析结果

2.4.1 加标回收率考察

称取阴性样品约5 g，共9份，精密加入适量黄曲霉毒素B1标准品，按1.3.3操作，制得供试品溶液，按1.3.1色谱条件进行测定。结果显示，高、中、低3种浓度的加标回收率平均值分别为100.4%、98.5%和97.3%，满足GB/T 27404—2008标准要求（60%～120%），结果见表1。

2.4.2 重复性考察

称取阳性样品5 g，重复测定6次，其相对标准偏差为0.6%，满足GB/T 27404—2008标准要求（≤30%），结果见表2。

2.4.3 质控样考察

称取质控样品约5 g，共3份，按1.3.3操作制得供试品溶液。按1.3.1色谱条件进行测定，结果为1.62 ?g·kg-1。所选质控样来自中食国实（编号为CFAPA-QC618B-1），指定值为1.55 ?g·kg-1，通过数据分析得出测定结果的Z值为0.5，符合质控样Z值要求（|Z|≤2）。

2.4.4 检出限考察

称取阴性样品约5 g，共3份，加入黄曲霉毒素B1标准品0.15 ng，按1.3.3操作制得供试品溶液。按1.3.1色谱条件进行测定，结果为0.029 ?g·kg-1，小于标准给定检出限（0.03 ?g·kg-1），满足GB 5009.22—2016标准要求。

2.4.5 定量限考察

称取阴性样品约5 g，共3份，加入黄曲霉毒素B1标准品0.5 ng，按1.3.3操作制得供试品溶液。按1.3.1色谱条件进行测定，结果为0.098 ?g·kg-1，小于标准给定定量限（0.1 ?g·kg-1），满足GB 5009.22—2016标准要求。

3 結论

本研究对GB 5009.22—2016第三法高效液相色谱-柱后衍生法进行了优化，样液净化环节用超纯水代替了PBS溶液，去掉了原标准中的氮吹环节。在优化的条件下测定食用油中黄曲霉毒素B1，目标峰峰形良好，保留时间在8.4 min左右，杂峰与目标峰分离度好，干扰小。该方法简单、快速、高效、节约试剂，为食用油中黄曲霉毒素B1的定性、定量分析提供了一种更加省时省力的途径，使实验室大批量检验工作实现了节能减负。

参考文献

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[11]国家卫生健康委员会，国家市场监督管理总局.食品安全国家标准 化学分析方法验证通则：GB 5009.295—2023[S].北京：中国标准出版社，2023.