人参皂苷Rb1与红景天苷对抗皮肤光老化作用的研究

沈干,金钰,陈德监,李昌

(南京医科大学第二附属医院东院整形美容科,江苏南京 210003)

日光是环境中促使皮肤老化的最重要因素,长期 慢性的紫外线照射可引起皮肤细胞的脂质过氧化物增多,端粒序列缩短,使细胞寿命缩短,细胞死亡;同时长期慢性的紫外线照射还使细胞分泌金属蛋白酶增加,分解真皮的弹力纤维和细胞间基质量,一旦胶原降解,则皮肤菲薄,产生皱纹,这就是皮肤的光老化。减少自由基的产生和清除老化代谢产物,提高抗氧化酶活性已成为目前延缓皮肤衰老的有效方法。在中草药中寻找高效、无副作用的天然自由基清除剂的研究已日益成为医药学和日用化学品科学一个十分活跃的研究领域。本研究就人角质形成细胞在中波紫外线(ultraviolet B,UVB)辐照后,中药成分人参皂苷Rb1和红景天苷对细胞内抗氧化酶活性及丙二醛(MDA)含量的影响进行观察,现报道如下。

1 材料和方法

1.1 细胞培养

使用含10%小牛血清(杭州四季青生物公司)的RMPI-1640培养液(Gibco公司),在37℃、体积分数为5%CO2培养箱(美国Heraeus)中培养人角质形成细胞系HaCaT细胞(由南京医科大学骆丹教授惠赠)。传代时以胰酶消化,以1×106ml-1的细胞浓度定量接种于96孔板中,继续培养,待细胞达70%融合时用于实验。

1.2 实验分组

本实验分为空白对照组(0 J◦cm-2UVB照射组)、60 J◦cm-2UVB+人参皂苷Rb1组(人参皂苷Rb1浓度分别为0、20、50、100μg◦ml-1)、60 J◦cm-2UVB+红景天苷组(红景天苷浓度分别为0、20、50、100μg◦ml-1),每组3个孔,按照不同组别接受药物和或照光处理,照光后继续培养24 h。

1.3 紫外线照射

HaCaT细胞生长至70%融合时予UVB照射,照射前先弃去各孔细胞培养液,PBS清洗2遍后留少量PBS覆盖细胞,与辐照灯管15 cm照射,然后弃覆盖液,换回常规培养液。

应用UVB辐照度监示器(上海Sigma公司)标定SUV-100日光紫外线模拟器(上海Sigma公司)的辐照度。UVB剂量=UVB辐照度 ×辐照时间(min)。在既往的研究基础上,本研究选用的照射剂量是60 J◦cm-2。

1.4 MTT法检测细胞增殖活性

UVB辐照后,分别在培养液中加入不同浓度的人参皂苷Rb1和红景天苷。孵育24 h后加入MTT 20μl(5 ml◦ml-1),再孵育4 h后弃去上清液,加入100μl二甲亚砜(DMSO),室温振荡15 min。使用酶标仪于570 nm波长测定每组吸光度值,空白试剂孔调零,读取吸光度值,观察各组细胞的增殖活性。

1.5 中药对抗UVB照射所致氧化损伤作用的指标检测

以试剂盒(南京建成生物工程公司)检测在UVB照射后加药各组及未加药对照组细胞的谷胱甘肽(GSH)、超氧化物歧化酶(SOD)、氧化氢酶(CAT)活性及丙二醛(MDA)含量,以吸光度值显示其含量。

1.6 统计学处理

2 结 果

2.1 在UVB照射后不同浓度的人参皂苷Rb1对HaCaT细胞增殖活性的影响

HaCaT细胞经60 J◦cm-2UVB照射后,加入人参皂苷Rb1,结果显示,细胞增殖活性渐增强(P＜0.05),并且在一定浓度范围内随人参皂苷浓度增加这种细胞保护作用增强(表1)。

表1 不同浓度人参皂苷Rb1在UVB(60 J◦cm-2)照射后HaCaT细胞增殖活性的变化(±s)

表1 不同浓度人参皂苷Rb1在UVB(60 J◦cm-2)照射后HaCaT细胞增殖活性的变化(±s)

与空白对照组比较,a P＜0.05

人参皂苷Rb1/μg◦ml-1 HaCaT细胞增殖活性0 0.264 5±0.007 20 0.581 2±0.007a 50 0.607 7±0.007a 100 0.593 6±0.007a

2.2 在UVB照射后不同浓度的红景天苷对HaCaT细胞增殖活性的影响

HaCaT细胞经60 J◦cm-2UVB照射后,加入红景天苷,结果显示细胞增殖活性渐增强(P＜0.05),并且随红景天苷浓度增加这种细胞保护作用增强(表2)。

表2 不同浓度红景天苷在UVB(60 J◦cm-2)照射后HaCaT细胞增殖活性的变化(±s)

表2 不同浓度红景天苷在UVB(60 J◦cm-2)照射后HaCaT细胞增殖活性的变化(±s)

与空白对照组比较,a P＜0.05

红景天苷/μg◦ml-1 HaCaT细胞增殖活性0 0.378 6±0.009 20 0.601 1±0.155a 50 0.6273±0.032a 100 0.6320±0.021a

2.3 人参皂苷Rb1对UVB照射后HaCaT细胞SOD、GSH、CAT活性和MDA含量的影响

与空白对照组相比,UVB照射后细胞SOD、GSH、CAT活性明显下降,MDA含量增加,差异有统计学意义(P＜0.05)。

60 J◦cm-2UVB照射后,人参皂苷Rb1(20、50、100μg◦ml-1)处理组与未加药(0μg◦ml-1)组相比,SOD、GSH、CAT活性明显要高,分别高出了约3倍、2倍和2.5倍;而MDA含量在60 J◦cm-2UVB照射后,人参皂苷Rb1组比未加药组(0μg◦ml-1)低,差异均有统计学意义(P＜0.01)(表3)。

表3 不同浓度人参皂苷Rb1对UVB照射后HaCaT细胞SOD、GSH、CAT活性及MDA含量的影响(±s)

表3 不同浓度人参皂苷Rb1对UVB照射后HaCaT细胞SOD、GSH、CAT活性及MDA含量的影响(±s)

与空白对照组比较,a P＜0.05;与未加药组比较,b P＜0.01

组 别SOD活性GSH活性MDA含量CAT活性空白对照组64.28±0.68 3.81±0.22 1.28±0.18 2.67±0.16 60 J◦cm-2+人参皂苷Rb1 0μg◦ml-1 13.62±2.21a 0.92±0.10a 4.30±0.18a 1.44±0.18a 20μg◦ml-1 39.06±3.28b 2.04±0.55b 1.02±0.12b 2.28±0.08b 50μg◦ml-1 43.35±2.09b 2.11±0.54b 1.26±0.26b 2.64±0.18b 100μg◦ml-1 36.02±1.12b 1.89±0.11b 1.29±0.16b 1.86±0.09b

2.4 红景天苷对UVB照射后HaCaT细胞SOD、GSH、CAT活性和MDA含量的影响

与空白对照组相比,UVB照射后细胞SOD、GSH、CAT活性明显下降,MDA含量增加,差异有统计学意义(P＜0.05)。

60 J◦cm-2UVB照射后,红景天苷(20、50、100μg◦ml-1)处理组与未加药(0μg◦ml-1)组相比,SOD、GSH、CAT活性明显要高,分别高出了约3.5倍、2.5倍和1.5倍;而MDA含量在60 J◦cm-2UVB照射后,红景天苷组比未加药组(0μg◦ml-1)低,差异均有统计学意义(P＜0.01)。

表4 不同浓度红景天苷对UVB照射后HaCaT细胞SOD、GSH、CAT活性及MDA含量的影响(±s)

表4 不同浓度红景天苷对UVB照射后HaCaT细胞SOD、GSH、CAT活性及MDA含量的影响(±s)

与空白对照组比较,a P＜0.05;与未加药组比较,b P＜0.01

组 别SOD活性GSH活性MDA含量CAT活性空白对照组64.28±0.68 3.81±0.22 1.28±0.18 2.67±0.16 60 J◦cm-2+红景天苷组0μg◦ml-1 13.62±2.21a 0.92±0.10a 4.30±0.18a 1.44±0.18a 20μg◦ml-1 45.05±0.99b 3.08±0.32b 3.04±0.30b 2.64±0.10b 50μg◦ml-1 37.35±2.76b 2.72±0.07b 2.41±0.32b 2.17±0.14b 100μg◦ml-1 39.76±2.29b 3.06±0.15b 2.14±0.11b 1.76±0.17b

3 讨 论

皮肤是人体最大的器官,担负着保护、感觉、调节体温、分泌和排泄、吸收、代谢、免疫等诸多方面的功能。皮肤衰老是人体衰老的一个重要表现。皮肤老化分为两种:一种是固有性老化,又称自然老化,是由遗传因素和不可抗力因素(如重力作用、机体内分泌及免疫功能随机体衰老的改变)引起的;另一种是由环境因素如紫外线、吸烟、风吹及接触化学物质等引起的外源性老化。而由于日光的长期反复照射是环境中影响皮肤老化的最重要因素,因此又称光老化。自然光线中的紫外线对皮肤表皮细胞和真皮成纤维细胞的都会造成损害,其中波长在280～320 nm的紫外线(即UVA)由表皮吸收,波长在320～400 nm的紫外线(即UVB)可作用于表皮细胞和真皮的成纤维细胞[1]。

日光中的紫外线通过下列机制使皮肤损伤:(1)损伤皮肤细胞的DNA;(2)进行性蛋白质(如胶原)的交联;(3)通过诱导抗原刺激反应的抑制途径而降低免疫应答;(4)产生高度反应的自由基与各种细胞内结构相互作用而造成细胞和组织的损伤。紫外线还可直接抑制表皮朗格罕细胞的功能,引起光免疫抑制,使皮肤的免疫监督功能减弱而引起皮肤的光老化,并且长期光照的皮肤中微血管数量减少,使皮肤的营养状况较年轻的皮肤差,更易导致皮肤的老化。

分子机制方面,长期慢性的紫外线照射可引起皮肤细胞的脂质过氧化物增多,可使端粒序列缩短,细胞寿命缩短,使细胞死亡;同时长期慢性的紫外线照射还使细胞分泌金属蛋白酶(matrix metalloproteinases,MMPs)增加,分解真皮的弹力纤维和细胞间基质量,其中MMP-1裂解Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ型胶原,MMP-9裂解Ⅳ、Ⅴ型胶原以及明胶,这些胶原和明胶都是维持皮肤弹性和丰满度重要成分,胶原降解可使皮肤菲薄,产生皱纹[2]。

很多研究关注紫外线诱导的氧化损伤[3],紫外线照射使人角质形成细胞HaCaT产生超氧阴离子,使细胞内的H2O2大量增多,H2O2分解产生大量羟自由基,可引起细胞DNA断裂[4],在角质形成细胞凋亡中起主要作用[5]。减少自由基的产生和清除老化代谢产物,提高抗氧化酶活性已成为目前延缓皮肤衰老的有效方法。在中草药中寻找高效无副作用的天然自由基清除剂的研究,已日益成为医药学和日用化学品科学一个十分活跃的研究领域。

皂苷是中草药中一类重要的活性物质,皂苷由甾体或三萜连接糖基组成,分子中含有较多的羟基,具有较大的极性。近年研究表明,皂苷大多具有明显的抗氧化作用,而皂苷类物质大多能提高体内SOD、CAT等抗氧化酶的活性,从而增强机体抗氧化系统的功能,防止过多的氧自由基对机体的损害。

人参皂苷Rb1为人参的主要有效成分之一,已被证明有广泛的药理作用,如可明显抑制脑、心和肝脏组织中过氧化脂质形成,具有稳定细胞膜结构并增加其流动性,延缓神经细胞衰老及增智作用,甚至有抗癌等作用[6-7]。

红景天为景天科景天属多年生草本植物,其主要药理活性成分为红景天苷及其苷元酪醇、酪萨维、红景天素等。近年来研究证明,红景天苷具有抗疲劳、抗衰老、免疫调节、清除自由基、增强记忆、改善睡眠等多种药理作用[8]。

在我们的实验中,人参皂苷Rb1和红景天苷均显示了较强的光保护作用。我们选用人角质形成细胞HaCaT,即UVB主要作用的皮肤细胞进行观察,结果发现,该细胞在UVB(60 J◦cm-2)辐照后,细胞增殖率下降,氧化损伤的各指标也有显著变化。本研究采用的60 J◦cm-2UVB为适中辐照剂量,关于其他剂量UVB辐照对表皮细胞和真皮成纤维细胞的影响我们将作继续观察。

细胞辐照后,使用人参皂苷Rb1和红景天苷处理使细胞增殖活性较未用药的对照组增高(P＜0.05),细胞SOD、GSH、CAT活性较未用药的对照组明显升高(P＜0.01);尤其是CAT指标在人参皂苷Rb1组甚至高于无UVB照射的空白对照组;而MDA含量在UVB照射后,药物作用组比未用药组低(P＜0.01)。所有指标显示,这两种药物成分可以对抗UVB辐照后皮肤细胞的氧化损伤,起到很好的光保护作用。

在将来的试验中我们将采用分子生物学的手段检测人参皂苷Rb1和红景天苷作用后UVB照射的皮肤细胞的端粒酶活性、端粒长度、金属蛋白酶表达等指标,为中药在抗皮肤光老化的应用提供更科学的依据。

[1]李立,白雪涛.紫外线辐射对人类皮肤健康的影响[J].国外医学卫生学分册,2008,35(4);135-137.

[2]TRAUTINGER F.Mechanisms of photodamage of the skin and its functional consequences for skin ageing[J].Clin Exp Dermatol,2001,26(7):573-577.

[3]COLLINS A R,HORVATHOVA E.Oxidative DNA damage,antioxidants and DNA repair:applications of the comet assay[J].Biochem Soc Trans,2001,29(Pt 2):337.

[4]PETERSEN A B,GNIADECKI R,VICANOVA J,et al.Hydrogen peroxide is responsible for UVA-induced DNA damage measured by alkaline comet assay in HaCaT keratinocytes[J].J Photochem PhotobiolB,2000,59(1-3):123.

[5]WLASCHEK M,TANTCHEVA-POÓR I,NADERI L,et al.Solar UV irradiation and dermal photoaging[J].J Photochem Photobiol B,2001,63(1-3):41-51.

[6]王本详.人参抗衰老作用的探讨[J].吉林医学,1983,4(1):57.

[7]李向高.人参皂苷Rb1的药理作用研究[J].吉林农业大学学报,2004,26(6):649-652.

[8]佟力,席军.红景天苷的药理作用研究进展[J].中外医疗,2008,27(27):137-138.