一个低磷酸酶血症家系的基因突变分析

陈晨，王丽波，曹丽华，邢雪莎，王述森，麻宏伟，罗阳

（中国医科大学 1.基础医学院医学基因组学教研室，沈阳 110001；2.附属盛京医院发育儿科，沈阳 110004）

低磷酸酶血症（hypophosphatasia）是一种罕见的遗传性疾病，以骨骼和牙齿矿化缺陷，血清和骨碱性磷酸酶活性持续低水平或缺如为主要特征。目前对本病尚无有效的治疗方法。低磷酸酶血症是由于肝/骨/肾碱性磷酸酶基因（alkaline phosphatase，liver/bone/kidney，ALPL；MIM#171760） 突变所致，ALPL基因定位于1p36.1［1］，编码的蛋白是组织非特异性碱性磷酸酶（tissue-nonspecific alkaline phosphatase，TNAP）。该病的遗传方式较为复杂，呈常染色体显性或隐性遗传。本研究采集了一个低磷酸酶血症家系中1例低磷酸酶血症的患儿及其患病母亲的血样，采用PCR结合基因测序的方法寻找患者及其母亲的ALPL基因突变位点，进一步确认临床诊断，同时探讨患者发病的机制。

到汉武帝刘彻即位时，西汉储备的粮食层层积压，导致仓库爆棚；国库里铜钱积压太多，导致穿钱的绳子朽坏，铜钱散落无法计算。有钱就任性的刘彻，终于敢对匈奴人说“不”了。

1 材料与方法

1.1 研究对象

本研究由中国医科大学附属盛京医院发育儿科提供家系成员外周静脉血及病例资料，系谱图见图1。共采集到该家系中Ⅳ-1和Ⅲ-2两名成员的血样，先证者Ⅳ-1为2009年就诊于盛京医院的患者，男，3.5岁，以“腿弯3年”为主诉就诊，Ⅲ-2为先证者母亲。

1.2 方法

1.2.1 临床检查：查体发现先证者Ⅳ-1身高96.5 cm（-1SD），“O”型腿，双膝间距5 cm。实验室检查中Ⅳ-1血碱性磷酸酶 （alkaline phosphatase，ALP）95.5 U/L（参考值40~375 U/L），血钙、磷、镁、甲状旁腺素水平均正常。X线检查发现双侧股骨颈干角变小，股骨颈略短，双侧髋内翻，见图2。Ⅲ-2的血ALP为19.5 U/L（参考值40~150 U/L），其他检查结果正常。

2～5岁儿童的皮肤发育过程具有一定的特殊性，其皮肤含水比例高， 在不同环境中的水分丧失速度较快，同时皮肤层内的脂质含量偏低，容易受到自身免疫性因子或者外界病原体的感染而出现真皮层的病变[4]。2～5岁儿童的发病率在不同的年龄阶段中处于较高水平[5-6]，部分东部沿海省份的相关流行病学研究显示，2～5岁儿童不同类型皮肤疾病的总体发病率占到了其年龄段的第一位[7]。而皮肤病对于2～5岁儿童具有下列几个方面的主要影响[8-9]：①对于儿童自信心的培养具有较为显著的影响，增加了患儿自卑或者远期抑郁及焦虑的风险；②导致患儿对于学习兴趣的下降，影响到了其学习成绩及自身性格的形成。

1.2.2 提取基因组DNA：取患者Ⅳ-1和Ⅲ-2枸橼酸钠抗凝处理的外周静脉血各200μl，选用Universal Genomic DNA Extraction Kit Ver.3.0（TaKaRa）试剂盒提取基因组DNA，置于-20℃保存。

将患者Ⅳ-1的ALPL基因双向测序结果分别进行序列比对分析（Human BLAT Search，http：//www.genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgBlat），发现患儿第12外显子存在一个杂合突变c.1366G>A（p.G456R），即cDNA第1 366位G突变为A，导致456位的甘氨酸变为精氨酸，见图3。对患者母亲ALPL基因第12外显子进行测序分析，结果显示患者母亲Ⅲ-2存在相同的杂合突变。

2 结果

1.2.3 PCR扩增候选致病基因ALPL的外显子并进行测序分析：在UCSC网站获得ALPL基因的DNA序列，使用Primer Premier 5.0软件设计覆盖该基因编码区（包括外显子和内含子交界区）的引物，引物序列见表1。首先对先证者Ⅳ-1进行检测，PCR扩增该基因的 12个外显子，PCR反应体系为 2×GC Buffer I （Mg2+Plus）25 μl，dNTP Mixture（各 2.5 mmol/L）8 μl，上下游引物终浓度为 0.5 μmol/L，TaKaRa LA Taq 2.5 U，基因组 DNA约 200 ng，加ddH2O至50μl，PCR产物进行1.5%琼脂糖凝胶电泳检测后，切胶纯化后对PCR产物进行测序分析。测序结果利用UCSC数据库对测得的DNA序列进行核酸序列的同源性比对分析。在先证者基因水平检测到突变后，同样通过测序分析方法验证家系内其他患者是否存在相同位点的基因突变。

3 讨论

低磷酸酶血症是一种以骨矿化缺陷和组织非特异性碱性磷酸酶（TNAP）活性减低为主要特征的遗传性疾病，目前尚无根治方法，虽然有报道可以用自体间充质干细胞进行基因替代治疗［2］，但有效率和安全性尚待确定，因此基因诊断和遗传咨询显得更为重要。低磷酸酶血症致病基因ALPL定位于1p36.1，共包含12个外显子，编码524个氨基酸。参照人类基因突变数据库（Human Gene Mutation Database，HGMD）和国外学者建立的低磷酸酶血症基因突变数据库（http：//www.sesep.uvsq.fr/03_hypo_mutations.php），到目前为止共报道了ALPL基因的218个突变，绝大部分为错义突变，大约占79.3%，且突变主要集中在第5~6外显子和第9~12外显子。本研究中检测到的该家系的p.G456R的杂合突变，位于第12外显子，Ozono等［3］曾经报道过该突变并对其进行体外重组实验研究，结果显示p.G456R突变体导致碱性磷酸酶完全失去活性。

在蔡家堡乡、西山乡、东山等乡镇建立马铃薯“青薯2号”“青薯9号”全膜覆盖栽培技术标准化示范区80hm2，平均产量3.58×104kg，总产量达286.4×104kg；实现收入3.22万元·hm-2，总产值257.76万元(按0.9元/kg计算)；与露地常规栽培相比，增产0.85×104kg，增产率31.14%，增收0.77万元·hm-2；新增产量68.0×104kg，新增产值61.2万元。

ALPL基因编码的TNAP蛋白共分为4个功能区域，分别是冠区、酶激活位点、同源二聚体界面和钙结合位点，该蛋白通过形成同源二聚体而发挥活性。第456位的氨基酸靠近TNAP的同源二聚体界面，并且在哺乳动物中是十分保守的氨基酸，该位点由极性疏水性的甘氨酸变为碱性的精氨酸，很可能影响TNAP的蛋白结构和活性，因此初步认为p.G456R是该家系中患者疾病表型的关键影响因素。根据患者Ⅳ-1和Ⅲ-2的年龄和生化检查等临床表现，两者在临床表型上都属于轻型，轻型低磷酸酶血症可呈常染色体显性或隐性遗传。而在该家系中，根据系谱图可知，疾病在该家系中呈常染色体显性遗传，这与患者测序分析只检测到一个杂合基因突变的结果吻合。根据文献报道，检测到一个突变等位基因的轻型低磷酸酶血症患者多是（76.6%）由于杂合突变的显性负效应致病［4~6］，而本研究中的p.G456R接近TNAP蛋白同源二聚体界面，因此推断本家系更可能是由于杂合突变的显性负效应，即影响了正常二聚体的形成而致病，其具体机制有待进一步研究。

表1 扩增ALPL基因外显子的引物序列Tab.1 Primer sequence of ALPL gene exons

本研究在中国人群中首次报道了一个低磷酸酶血症家系ALPL基因编码区的杂合错义突变c.1366G>A，进一步丰富了基因突变数据库，有助于深入了解该基因的结构与功能，同时也确认了患者的临床诊断，为该家庭的遗传咨询和产前诊断提供了可靠的依据。

［1］Mornet E.Hypophosphatasia［J］.Orphanet JRare Dis，2007，2：40-47.

［2］Katsube Y，Kotobuki N，Tadokoro M，et al.Restoration of cellular function of mesenchymal stem cells from a hypophosphatasia patient［J］.Gene Ther，2010，17（4）：494-502.

［3］Ozono K，Yamagata M，Michigami T，et al.Identification of novel missense mutations（Phe310Leu and Gly439Arg）in a neonatal case ofhypophosphatasia［J］.JClin Endocrinol Metab，1996，81（12）：4458-4461.

［4］Delphine F，Isabelle B，Anne-Sophie L，et al.Mild forms of hypophosphatasia mostly result from dominant negative effect of severe allelesor fromcompound heterozygosity for severeand moderatealleles［J］.BMCMed Genet，2009，6（10）：51-59.

［5］Muller HL，Yamazaki M，Michigami T，et al.Asp361Val mutant of alkaline phosphatase found in patients with dominantly inherited hypophosphatasiainhibitstheactivityof thewild-typeenzyme［J］.JClin Endocrinol Metab，2000，85（2）：743-747.

［6］Lia-Baldini AS，Muller F，Taillandier A，et al.A molecular approach todominancein hypophosphatasia［J］.Hum Genet，2001，109（1）：99-108.